多指标综合评分法正交实验优选菊花的炒制工艺*

张姗姗 ，姚梦雪 ，范兰兰 ，江 瑜 ，苏 敏 ，汪小莉 ，洪 燕 ，韩燕全 ，吴德玲

（1.安徽中医药大学第一附属医院，国家中医药管理局中药制剂三级实验室，中药复方安徽省重点实验室，现代药物制剂安徽省工程技术中心，合肥 230031；2.安徽中医药大学，合肥 230031）

菊花为菊科植物菊（Chrysanthemum morifolium Ramat.）的干燥头状花序，其味苦、甘，性微寒，归肺、肝经，具有疏风清热、平肝明目、解毒消肿的功效[1]。菊花主要含有黄酮类、有机酸类、挥发油类等活性成分。现代药理研究表明菊花具有抗炎、抗菌、抗肿瘤、抗病毒和抗氧化等多种作用，目前临床多用于风热感冒、眩晕、目赤昏花等病症的治疗[2-4]。

炒菊花最先出现在宋代《类编朱氏集验医方》[5]，后在明清时期发展成炒黑《药笼小品》[6]和煨炭《本草害利》[7]。清代《本草便读》[8]记载生菊花味甘性寒，善于平息肝风和肝火。脾胃虚寒，食少泄泻之病，应该少用（《本草汇言》）[9]。《实用中药炮制学》中指出菊花采用文火炒至微黄色，可以降低其寒性[10]。清代《外科大成》[11]记载“烧炭存性”，菊花炒炭后具有制寒止血的功效，而疏散风热等作用减弱（《新编中药志》）[12]。历版《中华人民共和国药典》（简称“中国药典”）均未收录炒菊花，而上海市2008年版《中药饮片炮制规范》和浙江省1986年版《中药饮片炮制规范》等[13-16]炮制规范收录了炒菊花，其炮制程度类似，以炒至表面微具焦斑或呈焦黑色为准。在菊花实际炒制过程中，具体的炮制工艺参数不清楚，炮制终点主要靠个人经验判断，导致炒菊花的质量参差不齐，进而影响其临床疗效。本实验采用多指标综合评分法正交实验，同时测定绿原酸、木犀草苷、3，4-二咖啡酰基奎宁酸、3，5-二咖啡酰基奎宁酸、木犀草素、芹菜素、总黄酮含量，并以这6种成分和总黄酮含量为考察指标，对菊花炒制工艺进行优化，以期为菊花炒制工艺的建立提供参考。

1 仪器及试剂与药品

1.1 仪器 Aglient-8453型紫外分光光度计（济南赛场科学仪器有限公司），KDC-16H型离心机（科大创新股份有限公司中佳分公司），BZF-6050型真空干燥箱（上海博讯实业有限公司），BP211D型电子天平（德国Sartorius公司），KQ3200D型超声波清洗仪（江苏省昆山超声仪器有限公司），Waters Acquity型超高效液相色谱（UPLC）柱（美国Waters公司），AS-D400A红外线测温仪（武汉中测宏图测量仪器有限公司）。

1.2 试剂与药品 绿原酸（批号：327-97-9），木犀草苷（批号：5373-11-5），3，4-二咖啡酰基奎宁酸（批号：12041114），3，5-二咖啡酰基奎宁酸（批号：2450-53-5），木犀草素（批号：491-70-3），芹菜素（批号：520-36-5），芦丁（批号：100080-200707），对照品均购买自成都曼思特生物科技有限公司，甲醇和乙腈均是色谱纯，水为屈臣氏蒸馏水，其他实验试剂均为分析纯。菊花购自亳州市佰世信中药饮片有限公司，批号：170803，经文章通讯作者韩燕全主任中药师鉴定为菊科植物菊（Chrysanthemum morifolium Ramat.）的干燥头状花序。采用UPLC法对菊花中绿原酸、木犀草苷、3，5-二咖啡酰基奎宁酸含量进行测定，结果均符合2015年版《中国药典》规定。

2 方法与结果

2.1 炒菊花的制备 称取干净的菊花15 g，放入炒制容器内，按照2015年版《中国药典》（四部）炮制通则“0213”项下清炒法炮制，采用文火炒制，炒至菊花颜色呈现深黄色时取出，放置摊凉，筛去多余的碎屑，放于粉碎机中粉碎，留存备用。

2.2 方法学考察

2.2.1 色谱条件 色谱柱：Waters Acquity BEH C18（2.1mm×100mm，1.7μm）；柱温30℃，流速0.2mL/min，进样量为 1 μL，以乙腈（A）-0.1%的磷酸（C）为流动相，检测波长为 348 nm，梯度洗脱（0-4 min，18%～20%A；4-9 min，20%A；9-11 min，20%～25%A；11-13 min，25%～35%A；13-18 min，35%～10%A；18-20 min，10%～18%A；20-22 min，18%A）。在该色谱条件下，炒菊花与混合对照品色谱图见图1。

图1 混合对照品与炒菊花的UPLC图

2.2.2 混合对照品溶液的制备 分别精密称取绿原酸、木犀草苷、3，4-二咖啡酰基奎宁酸、3，5-二咖啡酰基奎宁酸、木犀草素、芹菜素对照品适量，置于10 mL容量瓶中，加70%甲醇定容至刻度，制成浓度分别为51 μg/mL绿原酸、25 μg/mL木犀草苷、8.3 μg/mL 3，4-二咖啡酰基奎宁酸、129 μg/mL 3，5-二咖啡酰基奎宁酸、7.2 μg/mL 木犀草素、35 μg/mL芹菜素的混合对照品溶液。

2.2.3 供试品溶液的制备 精密称取菊花粉末（过1号筛）0.25 g，置于50 mL具塞锥形瓶中，再精确量取70%甲醇25 mL，加入锥形瓶中，密封塞紧，称取重量，在功率为300 W，频率为45 kHz条件下超声提取40 min，放冷后，称取重量，采用浓度为70%甲醇补足减失的重量，混匀后，经0.22 μm的微孔滤膜过滤，然后取续滤液，即得。

2.2.4 线性关系考察 分别精密吸取混合对照品溶液 0.5、1、2、3、4、5 μL，根据上述色谱条件进样，以绿原酸、木犀草苷、3，4-二咖啡酰基奎宁酸、3，5-二咖啡酰基奎宁酸、木犀草素、芹菜素各对照品的浓度（μg/mL）为横坐标（X），以峰面积为纵坐标（Y）进行线性回归，结果见表1。

表1 6种成分的线性回归方程

2.2.5 精密度实验 精密吸取上述混合对照品溶液1 μL，按照上述色谱条件进样，重复进样6次，记录6种成分的峰面积，计算得到绿原酸、木犀草苷、3，4-二咖啡酰基奎宁酸、3，5-二咖啡酰基奎宁酸、木犀草素、芹菜素峰面积的相对标准偏差（RSD）值在0.12%～0.41%之间，表明仪器精密度良好。

2.2.6 稳定性实验 分别精密吸取同一份炒菊花供试品溶液，分别在 0、4、8、12、16、24 h 进样，按照上述色谱条件测定，计算得到绿原酸、木犀草苷、3，4-二咖啡酰基奎宁酸、3，5-二咖啡酰基奎宁酸、木犀草素、芹菜素峰面积的RSD值在0.20%～1.06%之间，表明样品溶液在24 h内稳定。

2.2.7 重复性实验 取同一份炮制品炒菊花分为6份，按照上述条件制备6份供试品溶液。按照上述色谱条件进样测定，计算得到绿原酸、木犀草苷、3，4-二咖啡酰基奎宁酸、3，5-二咖啡酰基奎宁酸、木犀草素和芹菜素6种指标成分含量的RSD值在0.19%～1.01%之间，说明供试品样品处理方法重复性良好。

2.2.8 加样回收率实验 准备已明确其含量的6份炒菊花，根据上述条件制备6份供试品溶液，每份供试品精确吸取0.5 mL，在每份供试品中加入与样品中成分含量接近的对照品，混匀后，选择0.2 μm微孔滤膜过滤，根据上述色谱条件进样测定，计算得到绿原酸、木犀草苷、3，4-二咖啡酰基奎宁酸、3，5-二咖啡酰基奎宁酸、木犀草素和芹菜素的平均加样回收率在96.88%～110.3%之间，RSD在0.00%～0.48%之间，说明该方法准确良好。

2.3 总黄酮含量测定 精密称取芦丁对照品5 mg，放于25 mL容量瓶中，加甲醇定容至刻度，混匀，即制备成浓度为200 μg/mL的芦丁对照品溶液，放置于冰箱保存，待用。

用移液管精确量取芦丁对照品溶液0、1、2、3、4、5 mL，各自放于25 mL容量瓶里，加蒸馏水6 mL，加5%亚硝酸钠（NaNO2）溶液1.0mL，摇匀放置6min，加 10%硝酸铝[Al（NO3）3]溶液 1.0 mL，摇匀放置6 min，加 4%氢氧化钠（NaOH）溶液 10 mL，加蒸馏水至刻度，摇匀，放置15 min。以第1管为空白对照，在510nm波长处用紫外分光光度计测定A值[17]。以芦丁浓度为横坐标（X），A值为纵坐标（Y^），得到线性回归方程为Y^=16.03X-0.015 4，r=0.999 2。

精密量取样品溶液2 mL，按照上述方法进行操作，把波长设置成510 nm，依次用紫外分光光度计测定各个样品的A值，每个样品均需测3次，把样品的A值代入线性回归方程中，计算得到样品中总黄酮的含量。

2.4 数据处理与分析 采用综合加权评分法评估菊花炒制工艺，根据其药理作用及药效方面的药用价值，将总黄酮的权重系数设为0.4，其他6个成分的权重系数分别设为0.1。综合评分=（总黄酮含量/总黄酮最大含量）×100×0.4+（绿原酸含量/绿原酸最大含量）×100×0.1+（木犀草苷含量/木犀草苷最大含量）×100×0.1+（3，4-二咖啡酰基奎宁酸含量/3，4-二咖啡酰基奎宁酸最大含量）×100×0.1+（3，5-二咖啡酰基奎宁酸含量/3，5二咖啡酰基奎宁酸最大含量）×100×0.1+（木犀草素含量/木犀草素最大含量）×100×0.1+（芹菜素含量/芹菜素最大含量）×100×0.1，优化菊花炒制工艺。

2.5 单因素实验

2.5.1 炒制温度考察 称取干净的菊花饮片7份，每份15 g。将菊花放入炒制容器内，炒制温度分别设置成 90、110、130、150、170、190、210 ℃，炒制时间为5 min。根据上述条件制备供试品溶液，根据上述色谱条件进样，计算各个样品中总黄酮和上述6个成分含量，并进行综合评分，结果见表2。结果显示在炒制温度为130℃时，炒菊花的综合评分最高。

2.5.2 炒制时间考察 依据安徽中医药大学第一附属医院院内临方炮制炒菊花，以炒至深黄色为准，及2015年版《中国药典》（四部）炮制通则“0213”项下清炒法炒至微黄色或深黄色规定，把炒制时间设置为 6 个水平（5、6、7、8、9、10 min）。分别称取干净的菊花饮片6份，每份15 g。将菊花放入炒制容器内，分别炒制 5、6、7、8、9、10 min。根据上述条件制备供试品溶液，根据上述色谱条件进样，计算各个样品中总黄酮和上述6个成分的含量，并进行综合评分，结果见表3。结果表明当炒制时间为8 min时，综合评分最高。

表2 炒制温度考察结果

表3 炒制时间考察的结果

2.6 正交实验设计 在单因素实验的基础上，以炒制温度和炒制时间为考察因素，每个因素选择3个水平，以菊花6种成分和总黄酮含量为综合评分指标。采用多指标正交实验法，优化菊花炒制工艺[18-20]，因素水平见表4。

表4 因素水平表

2.7 正交实验结果按照L9（34）正交表进行正交实验，按照上述条件制备供试品溶液，根据上述色谱条件进样，计算6种成分的含量。按照“2.3”项下方法计算总黄酮的含量。采用综合加权评分法，优化菊花炒制工艺，结果见表5及表6。

表5和表6结果显示，各因素对实验影响程度为炒制温度＞炒制时间，在6～10 min炒制时间范围内，炒制时间对实验结果无显著影响，而炒制温度对实验结果有显著影响，差异具有统计学意义（P＜0.05）。正交实验的结果表明菊花的最佳炒制工艺为炒制温度130℃，炒制时间8 min。

2.8 验证实验 根据优选出的菊花炒制工艺制备3组炒菊花，对每组样品6种成分和总黄酮含量进行测定，得到3组验证实验的综合评分值，其综合评分值的RSD值为0.2%，说明此炒制方法稳定可行，结果如表7所示。

3 讨论与结论

实验考察了色谱柱、波长、柱温、进样量、流速和流动相等对色谱峰分离度的影响，最终确定色谱柱为WatersAcquityBEHC18（2.1mm×100mm，1.7μm），波长为348 nm，柱温为30℃，进样量为1 μL，流速为0.2 mL/min，流动相为0.1%磷酸-乙腈。在此条件下各色谱峰基线平稳，分离度良好。本实验选择的检测方法可靠稳定。

表5 正交实验设计与结果

表6 方差分析表

炒菊花是安徽中医药大学第一附属医院特色临方炮制品种之一，其炒制工艺及炒制相关参数未见报道。炒制温度和炒制时间等炮制因素可能对饮片的质量产生影响。本实验通过单因素实验，确定炒制温度和炒制时间为影响菊花质量的主要因素。黄酮类和有机酸类等成分是菊花的主要活性成分，在菊花中含量较高。文献报道，黄酮类成分中木犀草素、芹菜素和木犀草苷具有抗氧化、清除自由基和修复肝细胞损伤等药理作用。有机酸类成分中3，4-二咖啡酰基奎宁酸和3，5-二咖啡酰基奎宁酸具有清除超氧化物阴离子自由基和抗氧化作用[21]。而且2015年版《中国药典》将绿原酸、木犀草苷、3，5-二咖啡酰基奎宁酸作为菊花的主要活性成分。因此，本课题选择炒制温度和炒制时间为考察因素，选择绿原酸、3，4-二咖啡酰基奎宁酸、3，5-二咖啡酰基奎宁酸、木犀草苷、木犀草素、芹菜素、总黄酮含量为考察指标，最终优选出菊花炒制工艺为炒制温度130℃，炒制时间8 min。同时对工艺进行验证，得到3组验证实验的综合评分值，其综合评分值的RSD值为0.2%，说明此炒制方法稳定可行。

表7 最佳工艺结果分析