不同地理种群麦长管蚜对杀虫剂的抗药性与相关解毒酶的通径分析

武银玉,曹亚萍,范绍强,赵 飞,邢 鲲

(1 农业有害生物综合治理山西省重点实验室,太原030000;2 山西省农业大学小麦研究所,临汾041000)

蚜虫是小麦生产上的重要害虫,分布范围极广,为害严重[1]。 麦长管蚜(Sitobion avenae)是小麦穗蚜期麦蚜优势种群,在我国麦区发生密度相当大[2]。 近年来,随着全球气候变暖,我国北方地区冬季温暖少雨、年后气温回升快[3],不仅为小麦后期的穗蚜提供了适宜的生存和繁殖环境,而且使虫害呈现出提前发生、危害期长、峰期蚜量大等特点,对小麦生产造成严重威胁[4]。 目前生产上多采用化学药剂辅以精耕深翻、适时晚播等农业措施进行防治[5],但药剂长期过量使用造成麦蚜敏感性下降,抗药性问题日趋突出。

杀虫剂是害虫防治的有效途径之一[6],对杀虫剂产生抗药性是昆虫的自然适应性特征。 昆虫通过降低表皮穿透作用(行为抗性)和靶标部分的敏感性(靶标抗性),增强自身对药物的代谢能力(代谢抗性)这3 种途径实现对农药的抗性[6-7]。 其中,代谢抗性主要通过解毒酶来增强对农药的转化和降解,以此降低农药对其产生的毒性。 昆虫的解毒酶是一类异质酶系,主要包括羧酸酯酶(CarE)[8]、谷胱甘肽-S-转移酶(GSTs)[9]和多功能氧化酶(MFOs)[10]。

各地种群对不同杀虫剂产生的抗性程度不一,而不同种群代谢解毒酶的差异又必然影响各种群对药剂的敏感性。 本研究以山西省南部黄淮北片冬麦区的3 个不同地理种群麦长管蚜为研究对象,探讨麦长管蚜的抗性机理,为麦蚜的区域化治理和可持续控制提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 供试虫源

2019 年5 月上旬(小麦抽穗灌浆期)在山西南部小麦主产区选择3 个典型的麦蚜发生较重的地块:韩村(36°8′56.04″N,111°35′7.8″E)、张礼(35°59′24.36″N,111°25′15.24″E)、洪堡(36°12′5.76″N,111°32′2.04″E)。各地块分别采集1 000 头以上麦长管蚜,分别命名为韩村种群、张礼种群、洪堡种群,于室内条件下[温度:(22±1)℃;相对湿度50%—70%;光照17L:7D]用麦苗喂养10 d,选取个体大小一致的健康无翅成蚜进行生物测定[11]。 以室内不接触任何药剂连续饲养两年以上的麦蚜种群作为敏感种群(对照)。

1.2 主要试剂

杀虫剂(原药):95.3%吡虫啉、98%毒死蜱、95%高效氯氰菊酯、98%啶虫脒,购于利尔化学股份有限公司;95%抗蚜威购于郑州凯瑞农化工产品有限公司;羧酸酯酶CarE 活性测定试剂盒、谷胱甘肽-S-转移酶GSTs 活性测定试剂盒和多功能氧化酶MFO 活性测定试剂盒,均由苏州科铭生物技术有限公司生产;丙酮,天津市大茂化学试剂厂;磷酸二氢钠,天津登峰化学试剂厂;磷酸氢二钠,天津科密欧化学试剂有限公司;无水乙醇,天津市光复科技发展有限公司。

1.3 测定方法

1.3.1 毒力测定

采用玻璃管药膜法[12]略加改进,进行毒力测定。 先将杀虫剂用丙酮配置成2 000 mg∕L 的母液,储存于4 ℃冰箱,使用时用丙酮将母液稀释成所需浓度,从稀释好的药液中吸取180 μL 加入到直径2 cm、高5.2 cm 的玻璃管(内表面积36 cm2)中,将玻璃管放于操作台上匀速滚动,使药液均匀分布于玻璃管内壁,待丙酮挥发。 对照仅用丙酮处理。 每个玻璃管内放入成蚜20 头,用保鲜膜封口并刺以小孔。 每种药剂按照田间推荐用量等设6 个浓度梯度,重复3 次。 在室内正常饲养,3 h[13]后检查死亡率。 用毛笔轻触虫体,仅有一只足动或者完全不动者视为死亡,对照死亡率小于10%为有效测定。

1.3.2 酶活性测定

挑取100 mg 无翅成蚜,加1 mL 磷酸缓冲液,匀浆,4 ℃离心,吸取上清液作为待测母液,-20 ℃保存。不同种类的酶选用浓度不同的磷酸缓冲液和离心条件:羧酸酯酶(CarE)为pH 7.0、0.04 mol∕L 磷酸缓冲液,10 000g离心30 min;谷胱甘肽-S-转移酶(GST)为pH 7.5、0.1 mol∕L 磷酸缓冲液,8 000g离心10 min;多功能氧化酶(MFO)为pH 7.5、0.1 mol∕L 磷酸缓冲液,12 000g离心20 min。

酶活性测定参照各试剂盒说明书进行。 生物重复3 次。

1.4 数据处理

采用SPSS 22.0 软件进行数据分析。 运用机率值分析法[14]分别计算LC50值和抗性倍数。 采用Duncan 氏新复极差法进行酶活性差异显著性检验,并对抗性水平和酶活性进行相关分析和通径分析。

抗性倍数(Resistance ratio,RR)为田间种群LC50值与敏感种群LC50值的比值。 小麦蚜虫对杀虫剂的抗性水平[12]可分为6 个等级:RR ＜3 为敏感,3≤RR ＜5 为敏感性下降或耐药性,5≤RR ＜10 为低水平抗性,10≤RR ＜40 为中等水平抗性,40≤RR ＜160 为高水平抗性,RR≥160 为极高水平抗性。

2 结果与分析

2.1 不同地理种群麦长管蚜对杀虫剂的抗药性

由表1 可知,吡虫啉对麦长管蚜韩村、张礼、洪堡种群LC50分别为0.554 μg∕cm2、0.777 μg∕cm2、0.223 μg∕cm2,张礼麦区抗性水平最高,是敏感种群的4.92 倍,其次为韩村种群(3.51),两个种群抗性水平都处于敏感性下降阶段,洪堡种群尚处于敏感水平(1.41);抗蚜威对3 个麦长管蚜种群LC50分别为0.572 μg∕cm2、0.415 μg∕cm2、0.430 μg∕cm2。 韩村种群敏感性较差,达中抗水平(12.71),张礼、洪堡种群抗性水平相对较低,但也达到低抗水平(9.22,9.57);毒死蜱对3 个麦长管蚜种群的LC50分别为0.543 μg∕cm2、0.883 μg∕cm2、0.571 μg∕cm2,以张礼麦区对毒死蜱的抗性最高,达到11.62,处于中抗水平,其他两地种群均达到低抗水平;各地麦长管蚜对啶虫咪(0.74—1.28)和高效氯氰菊酯(0.65—1.06)表现为无抗性或仅处于敏感水平。

表1 不同地理种群麦长管蚜对不同药剂的抗药性水平Table 1 Resistance levels of Sitobion avenae to different insecticides in different geographical populations

2.2 不同地理种群麦长管蚜的解毒酶活性

由表2 可知,除洪堡种群多功能氧化酶活性有所降低外,其他种群的解毒酶活性相比室内敏感种群均有不同程度地上升。 韩村、张礼种群的羧酸酯酶活性分别为敏感种群的1.59 倍、1.84 倍,差异极显著,洪堡种群与敏感种群之间无显著差异;3 个种群谷胱甘肽-S-转移酶活性分别是敏感种群的1.78 倍、1.64 倍、1.38 倍,与敏感种群均达到极显著差异;韩村最高,与张礼种群间差异显著,与洪堡种群存在极显著差异;韩村、张礼种群的多功能氧化酶活性显著高于敏感种群,分别为敏感种群的1.54 倍和1.42 倍,洪堡种群多功能氧化酶活性与敏感种群无显著差异。

表2 不同地理种群麦长管蚜解毒酶活性Table 2 Comparison of detoxifying enzymes activities of Sitobion avenae in different geographical populations

2.3 麦长管蚜对杀虫剂抗药性水平与解毒酶活性的相关及通径分析

由表3 可知,麦长管蚜种群对吡虫啉的抗性水平与三种解毒酶活性存在显著正相关,与羧酸酯酶、多功能氧化酶活性相关系数分别为0.932、0.801,达到极显著水平,与谷胱甘肽-S-转移酶相关系数为0.708,达到显著水平;麦长管蚜对抗蚜威的抗性水平与谷胱甘肽-S-转移酶活性存在显著相关,相关系数为0.669;对毒死蜱的抗性水平与羧酸酯酶活性存在显著正相关,相关系数为0.697,与其他两种酶相关性不显著。

表3 麦长管蚜对各药剂的抗药性水平与三种解毒酶活性的相关性Table 3 Relevance between insecticide sensitivity and three detoxification enzymes activity of Sitobion avenae

为进一步明确各解毒酶活性对杀虫剂抗药性的作用,在相关分析的基础上进行了通径分析,结果表明:麦长管蚜GarE、MFO 对吡虫啉抗药性呈现正向效应(0.781,0.505),说明麦长管蚜通过提高体内这两种酶活性来达到分解吡虫啉的目的,GST 直接通径系数为负( -0.346),但由于GST 和MFO 两种酶对吡虫啉的正向效应(0.572,0.482)使其最终仍显示正相关(0.708);GST 对抗蚜威抗药性呈现正向效应(0.877),且达显著水平(0.669),说明GST 活性在麦长管蚜对抗蚜威抗性中起主要作用;MFO 对抗蚜威抗性水平呈正向效应(0.661),其通过GarE 呈现负效应( -0.918),相关性不显著(0.580);GarE 对抗蚜威抗性呈现负效应( -1.145),但因为间接作用表现为正向(0.643,0.530),最终与抗蚜威抗药性水平显示正相关(0.028);对毒死蜱抗药性呈现正向效应的只有GarE(1.346),其间接效应虽然表现为负效应( -0.614,-0.036),却不足以抵消GarE 活性对毒死蜱抗性的正向效应,相关性显示显著正相关(0.697),表示麦长管蚜主要通过提高体内GarE 酶活性来降低毒死蜱的浓度,其他两种酶直接通径系数为负,且对毒死蜱抗药性作用不显著。

表4 麦长管蚜对各药剂的抗性水平与三种酶活性关系的通径分析Table 4 Path analysis of the relationship between insecticide sensitivity and three enzyme activities of Sitobion avenae

3 讨论

化学药剂虽然能够在一定程度上遏制麦蚜种群数量的扩大[15],但是长时间、高频率、高剂量地应用,会使种群产生不同程度的抗性。 本研究结果表明,相较于室内敏感种群,山西省南部麦区麦长管蚜三个地理种群对各杀虫剂的抗药性存在一定差异,但整体趋于一致,其中对抗蚜威、毒死蜱已经产生低至中等水平抗性,对吡虫啉尚处于敏感或敏感性下降阶段,对啶虫咪、高效氯氰菊酯无抗性或仅处于敏感水平,这与当地经销商对某种药剂的推广力度及农户的用药频率等有关。 建议少用或不用抗蚜威和毒死蜱,混合使用吡虫啉,或选择低毒低残留的植物源类杀虫剂以避免抗药性继续发展,增加防治难度。

昆虫抗药性的产生是对杀虫剂进行选择的必然结果[16]。 昆虫在杀虫剂的选择压力下,通过增强体内解毒酶的活力和提高酶蛋白与杀虫剂分子的亲和性等方式,加速对杀虫剂的解毒代谢作用而使昆虫表现出抗药性[7]。 通常认为,高水平抗性由代谢抗性和靶标抗性共同作用产生,而较低水平抗性往往由代谢导致[17]。 本研究中种群抗药性水平较低,故测定了羧酸酯酶、谷胱甘肽-S-转移酶、多功能氧化酶三种代谢解毒酶活性,结果显示除洪堡种群多功能氧化酶活性下降外,其他种群的解毒酶活性相比室内敏感种群均有不同程度地上升。 相关分析和通径分析结果表明羧酸酯酶、多功能氧化酶与谷胱甘肽-S-转移酶三种解毒酶共同作用以降解吡虫啉对麦长管蚜的毒性,羧酸酯酶、多功能氧化酶起正向效应,谷胱甘肽-S-转移酶通过其他两种酶起间接作用。 邱高辉等[18]证实麦长管蚜对吡虫啉的抗性机制与羧酸酯酶和多功能氧化酶相关,本研究显示谷胱甘肽-S-转移酶也起一定作用。 谷胱甘肽-S-转移酶通过催化谷胱甘肽与有毒亲电子类物质发生结合反应,将其代谢为低毒物质排出体外达到解毒目的,还能作为载体结合蛋白俘获有毒物质,行使解毒功能[19]。 羧酸酯酶通过水解含酯键的杀虫剂,降低体内有毒物质的浓度,在对有机磷、拟除虫菊酯类杀虫剂的抗药性中起重要作用[20],本研究中,羧酸酯酶活性对毒死蜱抗性显示正向效应,表示麦长管蚜主要通过提高体内羧酸酯酶活力来降低毒死蜱的浓度。 总之,昆虫对药剂的代谢抗药机理相当复杂,在多种酶协同作用下,昆虫体内维持一种活性优化的平衡状态,以达到代谢杀虫剂的目的。

本研究虽然在一定程度上解释了麦长管蚜对杀虫剂的抗药性与解毒酶之间的关系,但还停留在生理生化水平,如要确定解毒代谢酶活性的提高是由于基因扩增或者表达的改变还是基因结构突变[21-22]等,还要进一步做分子水平的研究。