糖尿病视网膜病变病人血清微小RNA-29c、微小RNA-194 的表达

伍超，杨旭，陈桦，龚一波

糖尿病视网膜病变（DR）是Ⅱ型糖尿病（T2DM）的主要并发症［1］，同时也是最常见的眼底病变［2］，起初形成微血管瘤，后期严重时可导致视网膜脱落而失明。因此，及早发现早期预警标志物并作出诊断对DR防控具有重要意义。miRNA是一类参与到机体细胞增殖、迁移和凋亡过程中的非编码核酸小分子，并且有研究报道，miRNA 与眼科疾病的发展有密切联系［3］。DR 后期就伴随有新生血管和纤维增殖，miR-29c是miR-29家族中的一员，已被证实可参与细胞纤维化等病理过程［4］，提示miR-29c 可能与DR有关。有研究证明，miR-194在喉癌肾透明细胞癌、小细胞肺癌、胃癌等各种恶性疾病中表达异常［5］，T2DM 合并微量蛋白尿病人的尿液外泌体中，miR-194 表达量增高，表明miR-94 与糖尿病肾脏损伤有关［6］。但是关于miR-194在糖尿病病人眼底病变中作用尚未见研究，因此本研究从miR-29c、miR-194在DR病人血清中表达特点出发，研究其与病程的关系，现将结果总结如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料选取2015 年6 至2017 年9 月汉中市人民医院收治的DR病人98例为DR组，其中男性65 例，女性33 例，年龄范围35～79 岁，年龄（65.07±7.68）岁，糖尿病病程范围 4～27 年，病程（16.91±6.27）年。DR病人纳入标准：（1）确诊为糖尿病的病人，经裸眼视力、矫正视力、眼压、裂隙灯显微镜等眼科检查，由眼科专业医生确认为DR 病人；（2）年龄＞20 岁；（3）临床资料完整；（4）入院前未接受过任何治疗。排除标准：（1）合并心、肝、肾等脏器功能严重障碍者；（2）伴有急慢性感染性疾病、恶性肿瘤以及心脑血管疾病者；（3）存在精神疾病或交流沟通障碍者；（4）合并有糖尿病酮症酸中毒、风湿结缔组织病者；（5）合并白内障、青光眼等其他眼部疾病病人。选取同期本医院收治的T2DM 98例为DM组，其中男性 68 例，女性 30 例，年龄范围 37～78 岁，年龄（65.13±6.26）岁，糖尿病病程范围4～28年，病程（16.89±6.17）年。所有DM 病人都按照美国糖尿病学会颁布的糖尿病诊断标准（2010年）诊断糖尿病：（1）空腹血糖（FPG）≥7.0 mmol/L；（2）糖化血红蛋白（HbA1c）≥6.5%；（3）口服耐糖实验 2 h 血糖≥11.1 mmol/L。另以98 例同期在本院体检健康者为空白对照组（NC 组）。各组间年龄及性别等一般资料比较差异无统计学意义（P＞0.05），具有可比性。

本研究所有样品采集均取得病人及家属知情同意并签字，符合《世界医学协会赫尔辛基宣言》的相关要求。

1.2 主要试剂与仪器RNA提取试剂盒，购自于北京天根生化有限公司；AceQ qPCR SYBR® Green Mix，购自南京vazyme生物公司；引物，由上海生工生物公司等。qRT-PCR仪，购自美国Bio-Rad公司等。

1.3 研究方法

1.3.1血样制备 使用无抗凝剂干燥试管采取病人空腹状态静脉血5 mL，4 000 r/min，离心10 min，之后12 000 r/min，离心15 min 后取上清液分装于EP管中，-80℃保存备用。

1.3.2临床一般资料和生化检测 测量病人的血压、身高、体质量、体质量指数（BMI）。空腹10 h后，真空采血管采取肘静脉血，全自动生化分析仪测定病人血液中三酰甘油（TG）、总胆固醇（TC）、高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）、低密度脂蛋白胆固醇（LDLC）和空腹血糖（FPG）和糖化血红蛋白（HbA1c）。动脉硬化检测装置测踝肱指数（ABI）、脉搏波传导速度（PWV）。

1.3.3实施荧光定量PCR 检测miR-29c 与miR-194表达水平 采用RNA 提取试剂盒（天根）提取血清总RNA，反转录得cDNA。采用定量PCR 仪（Bio-Rad）对miR-29c和miR-194进行扩增。qRT-PCR 反应体系共 10 µL：miScript SYBR®Green Mix 5 µL，cDNA（50 ng/µL）1 µL，上下游引物（10 µM）各0.5µL，双蒸水（ddH2O）3.0 µL。反应条件：95 ℃，90 s；95 ℃，30 s；63 ℃，30 s；72 ℃，15 s；40 个循环。miR-29c 和miR-194 及内参U6 的引物序列见表1。采用2-ΔΔCT法对血清miR-29c和miR-miR-194表达水平进行定量分析。引物序列如表1所示。

表1 qRT-PCR引物序列

1.4 统计学方法利用SPSS 23.0 进行统计学分析，计数资料采用例（%）表示，行χ2检验；计量资料以±s 表示，行单因素方差分析；多因素logistic 回归分析DR 发生的危险因素，相关性分析采用Pearson相关分析。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 三组一般资料比较DR 组、DM 组和NC 组男女比例、年龄、病程、BMI、收缩压（SBP）和舒张压（DBP）比较，差异无统计学意义（P＞0.05），见表2。

2.2 三组血糖、血脂指标比较DR组、DM组和NC组TC、LDL-C、HDL-C、TG、ABI、PWV比较，差异无统计学意义（P＞0.05）；DR组、DM组HbA1c、FPG水平显著高于 NC 组，DR 组 HbA1c、FPG 水平显著高于DM组（P＜0.05），见表3。

表2 糖尿病视网膜病变病人、Ⅱ型糖尿病病人、体检健康者各98例一般资料比较

表3 糖尿病视网膜病变病人、Ⅱ型糖尿病病人、体检健康者各98例临床生化指标比较/±s

表3 糖尿病视网膜病变病人、Ⅱ型糖尿病病人、体检健康者各98例临床生化指标比较/±s

注：DR为糖尿病视网膜病变，T2DM为Ⅱ型糖尿病，NC为体检健康者，BMI为体质量指数，FPG为空腹血糖，HbA1c为糖化血红蛋白，TC为总胆固醇，TG为三酰甘油，LDL-C为低密度脂蛋白胆固醇，HDL-C为高密度脂蛋白胆固醇，ABI为踝肱指数，PWV为脉搏波传导速度

组别例数FPG/（mmol/L）HbA1c/%TC/（mmol/L）TG/（mmol/L）LDL-C/（mmol/L）HDL-C/（mmol/L）ABI左 右PWV/（cm/s）左 右NC组98 6.41±1.62 7.93±2.64 5.17±0.82 2.28±1.39 3.44±0.48 1.41±0.22 1.09±0.18 1.11±0.12 1 589.35±265.31 1 589.20±255.73 DR组98 9.41±1.76 9.40±1.61 5.35±1.34 2.29±1.46 2.96±1.58 1.39±0.34 1.11±0.10 1.12±0.14 1 635.24±245.33 1 630.25±238.01 DM组98 8.42±1.67 8.53±1.78 5.24±0.25 2.27±1.37 2.94±1.39 1.40±0.28 1.09±0.16 1.10±0.13 1 565.27±242.07 1 595.24±246.34 F值242.154 12.617 0.274 0.005 0.539 0.121 0.541 0.578 1.964 0.790 P值0.000 0.000 0.760 0.995 0.584 0.886 0.582 0.562 0.142 0.455

2.3 血清中miR-29c、miR-194表达量比较DR组和DM 组血清中miR-29c 表达水平明显高于NC 组，DR 组血清中miR-29c 表达水平明显高于DM 组（P＜0.05）；DR组和DM组血清中miR-194表达水平明显低于NC 组；DR 组血清中miR-194 表达水平明显低于DM组（P＜0.05）。见表4。

表4 糖尿病视网膜病变病人、Ⅱ型糖尿病病人、体检健康者各98例血清中miR-29c、miR-194表达量比较/±s

表4 糖尿病视网膜病变病人、Ⅱ型糖尿病病人、体检健康者各98例血清中miR-29c、miR-194表达量比较/±s

注：DR 为糖尿病视网膜病变，T2DM 为Ⅱ型糖尿病，NC 为体检健康者，miR-29c 为微小 RNA-29c，miR-194 为微小RNA-194；与NC组比较，aP＜0.05；与DM组比较，bP＜0.05

组别NC 组DR 组DM 组F 值P 值例数98 98 98 miR-29c 1.01±0.10 1.29±0.57ab 1.12±0.25a 14.722 0.000 miR-194 1.02±0.11 0.67±0.85ab 0.75±0.21a 12.698 0.000

2.4 糖尿病视网膜病变病人血清中miR-29c、miR-194 表达量与血糖、血脂水平相关性分析糖尿病视网膜病变病人血清中miR-29c、miR-194相对表达量与TG、TC、LDL-C皆无相关性（P＞0.05），miR-29c相对表达量与FPG 和HbA1c 值呈正相关（P＜0.05），与 miR-194 相对表达量显著负相关（P＜0.05）；miR-194 相对表达量与 FPG 和 HbA1c 值呈负相关（P＜0.05）。见表5。

表5 糖尿病视网膜病变98例血清miR-29c、miR-194相对表达量与生化指标相关性分析

表6 糖尿病视网膜病变98例多因素logistic回归分析

2.5 糖尿病视网膜病变发生的多因素logistic 回归分析对 DR 组和 DM 组的 FPG、HbA1c、miR-29c 和miR-194水平作为自变量，纳入多因素logistic回归分析发现（表6），FPG 水平高、HbA1c 水平高、miR-29c水平高是DR发生的独立危险因素（均P＜0.05），miR-194水平高是DR发生的保护因素（P＜0.05）。

3 讨论

DR 是糖尿病常见并发症中严重的致盲眼底病变［7］，DR 在初次确诊 T2DM 中发生率为 12% 左右，在糖尿病病人中占50%，糖尿病的病程越长越容易发展为DR［8］，在发达国家已成为有劳动力人群致盲的首要原因。临床上根据眼底是否有新生视网膜出现，将DR 分为增殖性视网膜病变和非增殖性性视网膜病变［9］，一旦进入增殖期，即使进行冷凝、光凝、玻璃体切割等治疗，视网膜依旧受损且视力受损不可逆，严重影响病人生活质量［10］。故尽早发现并确诊十分重要，深入了解与DR 相关的因子及其在DR中的变化特点可以协助控制DR病情的发展。

miRNA 通过诱导细胞分化、触发及调节炎症反应参与 DR 发生发展［11-12］。有研究表明，miRNA可通过抑制多个靶基因表达，调控糖尿病中多条相关信号通路，在糖尿病及其并发症发展过程中起着重要作用。近几年，研究报道miRNA 与增生型DR病人增生膜活力存在明显相关性，由此说明miRNA 在DR 的发生发展中扮演重要角色，但是miRNA 参与DR 的具体发病机制和生物学功能尚未明确。随后，研究发现糖尿病病人血清中miR-29 表达紊乱，说明miR-29 可能与糖尿病及其多种并发症发病过程有关［13］；吴心池等［14］研究证明在非增殖 DR 病人血清 miR-29c 表达上调；伍仙凤等［15］研究证实，糖尿病大鼠视网膜组织中miR-29c 表达量升高，并推测其与新生血管有关。本研究发现，DR病人血清中miR-29c 表达水平显著高于DM 组、NC组，DR 组病人血清中miR-29c 水平显著高于DM组，与上述研究结果一致，提示miR-29c 可能与DR有关。进一步分析发现，DR 病人血清中miR-29c相对表达量与HbA1c、FPG 值呈正相关，提示DR 病人miR-29c 相对表达量可能通过影响DR 病人血糖代谢影响疾病严重程度。

有研究证实miR-194 可作为糖尿病发生的潜在生物标志物［16］。本研究发现，DR 组和 DM 组血清中miR-194 表达水平明显低于NC 组，且DR 组血清中miR-194 表达水平明显低于DM 组，与上述研究结果一致，提示miR-194 可能通过调控下游基因表达，调控DR 疾病发生与发展。赵旭东等［17］在其研究中发现DR 病人体内出现明显糖脂代谢紊乱现象。本研究发现DR 病人血清中miR-194 相对表达量与HbA1c、FPG 值呈负相关，且与miR-29c 表达量显著负相关，提示miR-194、miR-29c 可能共同参与调解DR 病人血糖代谢。糖代谢紊乱是DR 发生的根本原因，吴心池等［18］研究发现，HbA1c 是DR 发病的独立危险因子，靶基因预测也提示miR-29c 可靶向调控胰岛素信号通路等参与血糖代谢。本研究通过多因素logistic 回归分析发现，FPG 水平高、HbA1c 水平高、miR-29c 水平高是DR 发生的独立危险因素，miR-194 水平高是DR 发生的保护因素，提示 miR-29c 和 miR-194 可能通过调控糖代谢等途径参与DR 病程。

但是，本研究样本量较小，今后研究将扩大样本量进一步确认，并通过生物信息学预测可能作用靶基因，进一步分析miR-29c和miR-194在DR疾病中具体作用机制。