N-myc 下游调控基因2 蛋白在喉鳞状细胞癌中的表达及对人喉表皮样癌细胞生物学特性的影响

赵谦，白艳霞，张少强，李宏慧，姚小宝，戴皓，邵渊

喉鳞状细胞癌是头颈部常见的恶性肿瘤，发病率高居所有头颈部鳞状细胞癌的第二位［1］。近年来，随着早期诊断及治疗手段的大幅进步，多种肿瘤相关致死率逐年下降［2-3］。但是，喉鳞状细胞癌病人的死亡率却无显著改善［4-5］。喉鳞状细胞癌的复发及进展是一个多因素、多阶段的过程，其病因涉及环境及基因等多方面原因。然而，喉鳞状细胞癌发生及进展的潜在分子机制研究成果较少。因此，鉴定喉鳞状细胞癌诊断及判断预后分子标志物，探索其余临床治疗及预后的相关性具有很高的价值。N-myc下游调控基因 2（N-myc，downstream regulated gene 2，NDRG2）近年来在国内首次克隆并报道并确定为潜在的抑癌分子［6］，NDRG2的过表达可显著抑制多种肿瘤细胞的增殖、侵袭及转移能力［7-8］。但是截至目前，NDRG2在喉鳞状细胞癌细胞的生物学特性尚无报道。本研究拟应用体内及体外实验的方法来研究NDRG2对喉鳞状细胞癌发生、发展的相关性。

N-myc 下游调控基因2 蛋白在喉鳞状细胞癌中的表达及对人喉表皮样癌细胞生物学特性的影响

图1 N-myc下游调控基因2（NDRG2）在癌旁组织（1A、1B）及喉鳞状细胞癌（1C、1D）中的表达（HE×200）：1A、1C为阴性，1B、1D为阳性图4 N-myc下游调控基因2（NDRG2）抑制Hep-2细胞转移能力（HE×200）：4A为对照组，4B为NDRG2抑制喉鳞状细胞癌转移图5 N-myc下游调控基因2（NDRG2）抑制Hep-2细胞侵袭能力（HE×200）：5A为对照组，5B为NDRG2抑制喉鳞状细胞癌侵袭插图10-1

1 材料与方法

1.1 一般材料

1.1.1临床标本 41 例喉鳞状细胞癌组织及癌旁组织于2014年1月1日至2017年12月31日在西安交通大学第一附属医院接受喉部分切除术的病人，其中男性37例，女性4例，年龄范围52～78岁，中位年龄63.7 岁。按TNM 分期，T1 有15 例（36.6%），T2有 12 例（29.3%），T3 有 10 例（24.4%），T4 有 4 例（9.8%）。组织标本切除后经4%多聚甲醛固定24 h，常规石蜡包埋、切片、储存于西安交通大学第一附属医院病理科。本研究符合《世界医学协会赫尔辛基宣言》关要求。

1.1.2实验试剂及仪器 免疫组化染色试剂盒购自福州迈新科技有限公司，QPCR 试剂盒购自日本TAKARA 公司，DEME 培养基购自美国 Gibco 公司，胎牛血清购自北京赛澳美细胞技术有限公司，兔抗人NDRG2抗体购自英国Abcam公司，羊抗兔二抗购自美国CST公司，NDRG2过表达慢病毒由上海吉凯科技有限公司设计并包装，Transwell 小室购自美国Millipore公司，基质胶购自美国BD公司。

1.2 方法

1.2.1免疫组化染色（Immunohistochemestry，IHC）喉鳞状细胞癌及癌旁组织石蜡切片常规脱蜡，高压抗原修复，3%过氧化氢阻断非特异性过氧化物酶，5%非免疫血清封闭，兔抗人NDRG2抗体一抗4 ℃孵育过夜，PBS清洗三次后，羊抗兔二抗室温避光孵育20 min，PBS清洗三次后，链霉菌抗生物素-过氧化酶染色20 min，PBS 清洗三次后，DAB 显色，苏木素复染，PBS 反蓝，水性封片剂封片，显微镜拍照检测。免疫组化评分根据染色强度及阳性染色范围进行综合评估。染色强度为蓝色计0分，淡黄色计1分，黄色计2 分，棕褐色计3 分。阳性染色范围5%～25%计1 分，26%～50%计2 分，51%～75%计3 分，76%～100%计4 分。两者乘积大于等于4 分判定为NDRG2阳性，乘积小于4分判定为NDRG2阴性。

1.2.2实时定量聚合酶链式反应（Quantitative realtime Polymerase Chain Reaction，QPCR）配置QPCR反应液：10 xbuffer 2µL，NDRG2或β-actin正义链引物1µL，NDRG2或β-actin反义链引物1µL，反转录模板2 µL，去离子水14 µL。程序设定为预变性95 ℃ 2 min；变性 94 ℃ 30 s，退火 60 ℃ 15 s，延伸72 ℃，35 个循环；4 ℃。NDRG2 正向引物序列：5’-GCCCAGCGATCCTTACCTACC-3’，NDRG2 反向引物序列：5’-GGCTGCCCAATCCATCCAACC-3’；β-actin正向引物序列：5’-CGTCTTCCCCTCCATCGT-3’；β-actin 反向引物序列：5’-GAAGGTGTGGTGCCAGATTT-3’。

1.2.3细胞培养及慢病毒感染 喉鳞状细胞癌Hep-2细胞及正常鼻咽上皮NP-69细胞购自于上海吉凯基因化学技术有限公司，培养基为10%胎牛血清的DEME培养液，细胞孵箱条件设置为：37 ℃，5%二氧化碳浓度。细胞铺6孔板，汇合度至40%左右时，行慢病毒感染实验。更换为1 mL无血清培养液，加入2µL NDRG2过表达或对照病毒及5µLEnhanced Infection Solution，感染12 h后更换为完全培养基。72 h后行Transwell检测两组细胞侵袭及转移能力的差异。

1.2.4蛋白质印迹法（Western Blot）提取感染NDRG2过表达及对照慢病毒组细胞蛋白，蛋白定量后，添加6x上样缓冲液，煮沸5 min，每孔加20µg蛋白样品。跑胶，电泳条件设定为恒压110 V，时间70 min。转膜至PVDF 膜，转膜条件设定为恒流300 mV，时间70 min。5%BSA 孵育 1 h，兔抗人NDRG2一抗（1∶800 稀释）4 ℃过夜孵育，TBST 清洗3 次后，羊抗兔二抗（1∶5 000稀释）室温孵育1 h，TBST清洗三次后，化学发光，拍照。

1.2.5Transwell 无血清培养基重悬感染 NDRG2过表达及对照病毒的Hep-2细胞，接种200µL共计60 000 个细胞至Transwell 小孔，每组设3 个副孔。其中细胞侵袭实验所用Transwell 小孔预先包被基质胶，细胞转移试验所用Transwell 小孔无需预先处理。将小室置于已加入600 µL 20%血清浓度DMEM培养基的24孔板中。24 h后，无水甲醇固定10 min，PBS清洗后，0.1%结晶紫染色10 min，PBS清洗，显微镜下拍照。

1.3 统计学方法所有数据均采用SPSS 22.0软件包进行分析。计量资料以±s表示，两组间差异分析采用独立样本双侧t检验；不同临床病理特征分组间NDRG2 阳性率差异分析采用χ2检验；P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 NDRG2在喉鳞状细胞癌组织中的表达如图1所示，喉鳞状细胞癌及癌旁组织中NDRG2免疫组化阳性染色主要定位于细胞质，伴轻微胞核和胞膜阳性染色。41例喉鳞状细胞癌组织中NDRG2阳性率为24.39%（10/41），癌旁组织中NDRG2阳性率为85.37%（35/41），差异有统计学意义（χ2=30.781，P=0.001）。

表1 N-myc下游调控基因2（NDRG2）阳性率在不同临床病理特征比较/例（%）

2.2 NDRG2 与喉鳞状细胞癌临床病理特征的关系卡方分析显示TNM III 和V 期喉鳞状细胞癌的NDRG2阳性率显著低于TNM I 和II期病人，淋巴结转移喉鳞状细胞癌病人中NDRG2 阳性率亦低于未发生转移病人（P＜0.05，表1）。其他临床病理特征分组间NDRG2 阳性率差异无统计意义。以上结果提示NDRG2可能参与抑制喉鳞状细胞癌淋巴转移。

2.3 NDRG2在Hep-2细胞中的表达QPCR及WB结果显示NDRG2 mRNA 及蛋白在喉鳞状细胞癌Hep-2细胞中的表达水平为1.193±0.053明显低于正常鼻咽上皮NP-69 细胞（0.238±0.072）（t=3.536，P=0.036）。提示NDRG2 可能在喉鳞状细胞癌中扮演抑癌分子的角色。见图2。

图2 NDRG2在喉鳞状细胞癌Hep-2细胞中的表达

2.4 NDRG2 过表达慢病毒对NDRG2 表达的影响为了检测NDRG2对Hep-2细胞侵袭及转移的影响，我们包装了NDRG2 慢病毒。QPCR 及WB 结果显示感染NDRG2慢病毒的Hep-2细胞（1.046±0.048）中NDRG2 mRNA 及蛋白表达水平较感染对照病毒的Hep-2细胞（5.878±0.483）均明显升高（t=4.825，P=0.017），见图3。

图3 NDRG2慢病毒可上调Hep-2细胞中NDRG2表达

2.5 NDRG2对Hep-2细胞转移能力的影响Transwell 实验结果显示，感染NDRG2 过表达慢病毒组转移细胞数目明显低于感染对照病毒组［Lv-control（141.328±23.424）个，Lv-NDRG2（54.925±16.825）个；t=4.413，P=0.023］，提示NDRG2 可抑制喉鳞状细胞癌细胞转移。见图4。

2.6 NDRG2对Hep-2细胞侵袭能力的影响Tran-swell 实验结果显示，感染NDRG2 过表达慢病毒组侵袭细胞数目明显低于感染对照病毒组（Lv-control（71.782±18.675）个，Lv-NDRG2（25.931±9.729）个，t=3.757，P=0.031），提示NDRG2 可抑制喉鳞状细胞癌细胞侵袭。见图5。

3 讨论

喉癌是头颈部的恶性肿瘤，近年来发病率不断升高，每年约增加25%，且生存预后差，严重危害人们的生活质量，喉鳞状细胞癌占喉癌发病人群的95%。关于喉鳞状细胞癌的发生机制方面的研究为临床的基因治疗提供了依据。NDRG2 是N-myc 的下游基因，又被称为分化相关基因，在组织中的表达水平随着发育、生长的过程不断的发生变化，NDRG2 基因对组织的生长、分化发挥着重要的作用。自NDRG2 发现以来，众多研究均证实NDRG2在包括喉鳞状细胞癌在内的多种肿瘤组织中表达下调，是公认的抑癌分子［9-10］。

国内研究报道NDRG1和NDRG2在喉鳞状细胞癌细胞癌组织中低表达，研究结果显示NDRG2 在45例喉鳞状细胞癌中的阳性率为33.3%，在18例癌旁组织中的阳性率为83.3%，差异有统计学意义［11］。与国内外既往研究结果一致，本研究表明，喉鳞状细胞癌组织中NDRG2 阳性表达率（24.39%）明显低于癌旁组织（85.37%）。与既往研究不同的是，本研究所用癌旁组织均为配对癌旁组织，减少了免疫组化染色中因病人组织来源差异带来的误差。研究结果显示：TNM III&IV 期喉鳞状细胞癌的NDRG2阳性率显著低于TNM I&II 期病人，说明NDRG2 可能参与喉鳞状细胞癌的发生、发展。对伴有淋巴结转移喉鳞状细胞癌病人中NDRG2 阳性率低于未发生转移病人，其他临床病理特征分组间NDRG2阳性率差异无统计意义，提示NDRG2可能参与抑制喉鳞状细胞癌淋巴转移。

在喉鳞状细胞癌的细胞学基础研究方面，本研究应用慢病毒过表达Hep-2细胞中NDRG2的表达，研究结果显示Hep-2 细胞NDRG2 基因及蛋白水平明显增高。细胞生物学特性的检测中，Transwell 迁移及侵袭实验结果显示：与普通Hep-2细胞相比，过表达NDRG2 的Hep-2 细胞侵袭及转移能力明显降低，证实了NDRG2 可能参与了喉癌的进展和转移，在临床上，NDRG2的表达水平的变化影响着喉鳞状细胞癌TNM分期及淋巴结转移，进而影响疾病的治疗效果与预后，与既往国内外此方面的研究结果及结论一致［11］。本研究通过喉鳞状细胞癌组织学水平及Hep-2 细胞学水平的研究相结合，实验结果达到了预期一致的结果，更有力的证实了NDRG2作为抑癌分子参与喉鳞状细胞癌发生及进展的过程。

在NDRG2与喉鳞状细胞癌发生、发展的机制研究中，NDRG2可调控肿多种瘤侵袭及转移相关蛋白及细胞信号转导通路，其中部分蛋白与通路已被证实对喉鳞状细胞癌侵袭及转移的发挥明确的调控因素。例如，上皮性钙黏附蛋白（E-cadherin）是钙粘附蛋白（cadherin）家族成员，可发挥一致肿瘤细胞侵袭及转移的作用，是已经取得共识的肿瘤抑制分子。相关的细胞及组织学实验显示，与早期喉鳞状细胞癌病人相比，E-cadherin 在中晚期喉鳞状细胞癌中表达下调，并与不良预后及生存期密切相关［12］。而多项研究已证实 NDRG2 与 E-cadherin 表达呈正相关。其可能的机制为NDRG2 可增强糖原合成酶激酶-3β（GSK-3β）的活性，从而导致Snail 溶酶体降解，进而导致 E-cadherin 转录抑制［13-14］。因此，在喉鳞状细胞癌中，NDRG2 也可通过此种机制上调E-cadherin的表达，从而抑制肿瘤侵袭及转移。NDRG2 与基质金属蛋白酶家族（MMP）的相关性也在近年来的研究中逐渐得到证实。MMP 家族蛋白是另一类与肿瘤侵袭及转移关系密切的促癌因素。MMP2和MMP9已被证实在喉鳞状细胞癌中表达上调，并在肿瘤的形成、进展及预后中扮演重要角色［15，16］，而 NDRG2 在多种肿瘤中可通过调控MMP2和 MMP9 的表达而抑制肿瘤侵袭及转移［10，17］。因此，通过抑制MMP2 和MMP9 的表达而发挥抑癌分子的作用，也可能是NDRG2抑制喉鳞状细胞癌侵袭及转移的分子机制之一。但是，NDRG2在喉鳞状细胞癌抑制侵袭及转移的具体机制，仍需进一步的实验来逐步阐明。

综上所述，本研究通过免疫组化从组织学方面证实发现NDRG2在喉鳞状细胞癌中表达下调，通过包装NDRG2 慢病毒提高喉鳞状细胞癌NDRG2 的mRNA 及蛋白表达水平，进而行细胞侵袭实验和迁移实验证实NDRG2 可抑制喉鳞状细胞癌Hep-2 细胞侵袭及转移，通过体内及体外实验相结合说明NDRG2可能在喉鳞状细胞癌的发生、发展中可能发挥重要的作用。在喉鳞状细胞癌的临床综合治疗中，以本NDRG2作为喉鳞状细胞癌靶向治疗的潜在的分子靶点，可能会发挥重要的治疗作用，具有较高的临床转化应用价值。

（本文图1，4，5见插图10-1）