小标本二步酶消化法分离人头皮毛乳头细胞

胡天星 余南岚 杨海潮 朱琳 杨希川

陆军军医大学第一附属医院皮肤科，重庆400038

毛乳头是位于毛囊基底部的特殊间质成分，在毛囊发育和周期性再生调控中起主导作用，毛乳头细胞功能异常是导致毛囊周期失衡和脱发的主要起始因素［1⁃2］。因此，体外培养毛乳头细胞是深入研究毛囊生物学和各种与毛发相关的功能代谢疾病的关键环节和基础［3⁃4］。但头皮标本获取困难，同时毛乳头位置隐蔽，分离与培养困难，严重限制了毛囊生物学的研究和发展。我们改良建立了一种简单、高效、易操作且高质量分离和培养小标本人头皮毛乳头细胞的方法，为进一步研究毛囊生物学提供细胞来源支持。

一、材料

1. 主要试剂：胎牛血清（德国PAN⁃Biotech 公司），DMEM/高糖培养基、0.25%胰蛋白酶（美国Hyclone 公司），0.6%分离酶Ⅱ、0.2%胶原酶Ⅳ（美国Sigma⁃Aldrich公司），一抗鼠抗人层黏连蛋白单克隆抗体、Ⅳ型胶原多克隆抗体（武汉三鹰生物技术有限公司），牛血清白蛋白（美国Genview公司），二抗3H-吲哚菁类染料标记的羊抗鼠IgG 抗体、4′，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）染色液、二甲基亚砜（上海碧云天生物技术有限公司）、青-链霉素溶液（以色列Biological Industries公司）。全培养基由10 ml血清、1 ml青-链霉素溶液、98 ml DMEM/高糖培养基配制。

2.标本来源和保存：2018 年9 月至2019 年1 月在陆军军医大学第一附属医院皮肤科收集3例头部色素痣、6例皮脂腺痣切除术废弃的含毛皮肤标本。其中，1例皮脂腺痣位于轻度雄激素性秃发区，标本大小为0.5 cm × 0.5 cm ～0.5 cm×1 cm。标本采集后立即置4 ℃无菌生理氯化钠溶液中保存，保存时间<12 h。所有标本采用小标本二步酶消化法分离毛乳头，1例色素痣和1例皮脂腺痣标本同时还采用一步酶消化法进行处理。本研究经解放军陆军军医大学第一附属医院伦理委员会批准（伦理审批号KY201977）。

二、方法

1. 标本消毒：在无菌培养皿中用75%乙醇浸泡标本3 遍，每次3 min，4 ℃无菌磷酸盐缓冲液（PBS）漂洗3 次后，移入装有PBS的无菌培养皿中。

2.小标本二步酶消化法分离毛乳头：①用镊子夹住标本，脂肪面朝上，用眼科剪尽量去除多余皮下脂肪组织，直至显露毛球部，剪下毛根部，置4 ℃无菌PBS中；②用镊子从毛根部分离出单个含毛球部的毛囊，转入含0.6%分离酶Ⅱ的培养皿中，37 ℃消化30 min，待毛干从结缔组织层分离出（图1A）；③去除培养皿中的分离酶，加0.2%胶原酶37 ℃消化30 ～60 min，此后每20 min 观察毛乳头游离情况，当包裹毛乳头的结缔组织层开始松散，毛乳头快要游离时立即加入3 倍体积的全培养基终止消化；④反复缓慢吹打3 ～5 次培养基，使毛乳头从结缔组织中释放出来，离心（1 000 r/min，5 min，离心半径15.5 cm，下同）、弃上清液，沉淀为毛乳头、毛干、结缔组织等混合物，用1 ml 全培养基重悬沉淀物并移入培养皿中，加3 ml DMEM/高糖培养基反复缓慢冲洗，用移液枪去除悬浮的毛干、残发及部分可见纤维组织；⑤继续低速离心（500 r/min，5 min）3次、弃上清液，用1 ml全培养基重悬沉淀物，移入无菌60 mm培养皿中，补齐3 ml全培养基，37 ℃、5%CO2培养箱中培养。

一步酶消化法：参考文献［5］的方法分离。

3.毛乳头细胞培养：将分离获得的毛乳头用全培养基于37 ℃、5%CO2培养箱中培养。12 h后首次观察毛乳头贴壁情况，此后每12 h 观察1 次。当所有贴壁的毛乳头开始迁出，进行第1 次半量换液，此后每隔24 h 半量换液1 次。计算毛乳头分离率（分离毛乳头数/毛囊数×100%）、贴壁率（贴壁毛乳头数/分离毛乳头数×100%），记录毛乳头细胞迁出时间。

待细胞完全迁出后重悬，去除原培养基，加0.25%胰蛋白酶1.5 ml，37 ℃消化1 min，镜检可见毛乳头边缘部细胞变圆，中心部细胞趋于圆形，镜下室温消化1 ～2 min，待中心部大部分细胞变圆后，去除胰蛋白酶，立刻加入1 ml全培养基终止消化，吹打细胞至完全脱落形成单细胞并均匀分布在培养基中，补齐3 ml全培养基，继续于37 ℃、5%CO2恒温培养箱培养，即为原代毛乳头细胞。

4.毛乳头细胞传代：将原代毛乳头细胞重悬后培养，融合约90%后及时进行传代，去除原培养基，加0.25%胰蛋白酶1.5 ml，37 ℃消化1 min，镜检可见部分细胞开始变圆，镜下室温消化1 ～2 min，待80%细胞变圆后，立刻加入1 ml全培养基终止消化，用移液器吹打细胞至完全重悬，移入无菌离心管离心（1 000 r/min，5 min），弃上清液，加2 ml 培养基重悬，按1∶2比例传代，补齐3 ml全培养基，继续放入37 ℃、5%CO2恒温培养箱培养，即为第1代毛乳头细胞。

5. 毛乳头细胞的鉴定：取第3 代毛乳头细胞，按每皿1 ×105个接种到激光共聚焦小皿上，37 ℃、5%CO2恒温培养箱中培养过夜，细胞密度约70%时，4%多聚甲醛室温固定20 min。PBS 漂洗3 次，0.5% Triton X⁃100 室温通透20 min，PBS漂洗3次，每次5 min。5%牛血清白蛋白室温封闭30 min，弃封闭液加入一抗4 ℃过夜。PBS漂洗3次，每次5 min，加二抗室温避光孵育30 min，PBS 漂洗3 次，每次10 min，DAPI 复染核，95%甘油封片，激光共聚焦显微镜下观察。

6.毛乳头细胞冻存：取第3 ～4代处于对数生长期的毛乳头细胞，0.25%胰蛋白酶消化，收集于离心管中离心（1 000 r/min，5 min），弃上清液，加900 μl胎牛血清重悬，缓慢加入100 μl 二甲基亚砜移入冻存管，4 ℃放置30 min，-80 ℃过夜，最后于液氮中保存。

7. 毛乳头细胞复苏：向15 ml 无菌离心管中加2 ml 全培养基，取冻存细胞，37 ℃水浴融化后转入离心管离心（1 000 r/min，5 min），弃上清液，加1 ml全培养基重悬，移入培养皿中，补齐3 ml 全培养基置37 ℃、5%CO2恒温培养箱培养，24 h后观察细胞贴壁生长情况。

三、结果

1.毛乳头分离：小标本二步酶消化法分离的头皮毛乳头镜下呈倒梨形，形态完整，部分可见残留真皮鞘（图1B），毛乳头分离率为60.8%±2.1%。而一步酶消化法未分离出毛乳头。毛乳头细胞分离方法比较见表1。

项目标本大小毛囊处理消化方法收集方法总操作时间实际操作时间毛乳头分离率（n=77）毛乳头贴壁率（n=47）一步酶消化法0.5 cm×0.5 cm ～0.5 cm×1 cm剪碎被脂肪包裹的毛囊部0.2%胶原酶Ⅳ37 ℃消化4 ～5 h显微镜下拾捡6.0 ～8.0 h 2.0 ～3.0 h小标本二步酶消化法0.5 cm×0.5 cm ～0.5 cm×1 cm剪下整块毛球部，分离单个毛囊0.6%分离酶Ⅱ37 ℃消化30 min；0.2%胶原酶Ⅳ37 ℃消化30 ～60 min低速离心收集（500 r/min，5 min，离心半径为15.5 cm）2.0 ～3.0 h 1.0 ～1.5 h 60.8%±2.1%33.7%±7.0%a改良二步酶消化法［6］>0.5 cm×1 cm剪取毛乳头组织，分离毛囊0.5%分离酶4 ℃消化6 ～8 h；0.2%胶原酶D 37 ℃消化4 h离心收集（2000 r/min，5 min，离心半径为15.5 cm）≥10.0 h≥2.0 h约40%约30%b 00

2.毛乳头细胞培养：小标本二步酶消化法分离出的毛乳头接种12 h 后出现贴壁，24 h 后贴壁的毛乳头即有大量细胞迁出，刚迁出的细胞呈短梭形（图1C）；48 h后细胞进一步迁出，细胞质丰富，呈长梭形（图1D）；60 h后细胞大面积迁出，初步呈聚集生长（图1E）；72 h后细胞基本迁出完成，随着细胞大量增殖，靠近毛乳头中心位置迁出的细胞呈多层聚集生长现象（图1F）。小标本二步酶消化法毛乳头细胞12 h 贴壁率为33.7%±7.0%，72 h 贴壁率为86.6%±3.9%，细胞迁出时间0.5 ～3.0 d，实验总操作时间2.0 ～3.0 h，减去消化等待时间，实际操作时间1.0 ～1.5 h。

3.毛乳头细胞传代：用上述方法传代后，第2代毛乳头细胞24 h 后即可见细胞贴壁生长，传代的毛乳头细胞重新呈凝集性生长趋势（图1G）。48 h后凝集性生长愈发明显。但随传代次数的增加，该细胞特有的凝集性生长趋势会逐渐消失，第9代细胞不再出现凝集性生长现象（图1H）。

4.免疫荧光鉴定毛乳头细胞：头皮毛乳头细胞同时表达Ⅳ型胶原和细胞层黏连蛋白（图2）。

5.毛乳头细胞复苏：复苏的细胞状态良好，48 h后开始呈现明显的凝集性生长状态（图1I）。

四、讨论

毛乳头是位于毛囊基底部特殊的间质成分，具有强烈的蛋白合成与旁分泌特征，毛乳头细胞具有凝集性生长特性［7］，其最显著的功能特点是诱导毛囊形成及再生［8］。体外分离培养头皮毛乳头细胞是研究毛囊的前提和基础。然而，头皮标本来源有限，大多为头部手术后的废弃组织，能获得的标本较小，且单个标本所含毛囊数通常<20个。目前头皮毛乳头细胞的分离方法主要包括显微解剖法和酶消化法。尽管显微解剖法中毛乳头获得率高，但获得的毛乳头贴壁率低、细胞迁出慢，且需特殊的体视显微镜，对操作人员的技术要求高，劳动强度大，且耗时长、效率低；一步酶消化法简便、易操作，但标本需求量大，且对毛囊质量要求高［9⁃10］。毛囊质量与能否成功分离培养毛乳头细胞有密不可分的关系，毛囊质量与患者年龄、毛发质量及术后废弃部位均有关［11］。这些因素均限制了人头皮毛乳头细胞的分离培养。因此，我们改良建立了小标本二步酶消化法，对分离、培养、保存小标本人头皮毛乳头细胞有重要意义。

小标本二步酶消化法操作简单、高效，0.6%分离酶Ⅱ37 ℃消化30 min 可实现毛乳头与毛囊上皮在基底膜的分离，0.2%胶原酶Ⅳ37 ℃下作用30 ～60 min可消化毛乳头周围的胶原纤维、脂肪组织和结缔组织等［12］，在分离酶和胶原酶的交替作用下通过500 r/min低速离心能够最大限度地将毛乳头从毛囊中分离出来，减少毛乳头的损伤和损失。对于毛囊质量不高的雄激素性秃发患者脱发区的毛囊用此方法也能成功分离出毛乳头，并培养毛乳头细胞。免疫荧光显示分离的细胞同时表达Ⅳ型胶原和细胞层黏连蛋白，可鉴定为毛乳头细胞［6］。与人头皮毛乳头细胞的改良二步酶消化法［6］和一步酶消化法［5］相比较，小标本二步酶消化法可明显缩短毛乳头分离时间，提高毛乳头分离率和贴壁率，缩短毛乳头细胞的迁出时间，提高低质量毛囊分离成功率（表1）。本研究中一步酶消化法未分离出毛乳头，原因可能是获取的标本小、毛囊质量差且数量少，初步处理标本的过程中，毛囊可能被破坏。

我们改良建立的小标本人头皮毛乳头细胞二步酶消化法既具有显微解剖法的低毛乳头损失优点，又具有一步酶消化法操作简单等特点，同时具备耗时短、对标本要求低等优点，是一种较为理想的小标本分离培养毛乳头细胞的方法，具有推广和应用价值。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突