小檗碱对皮肤鳞状细胞癌裸鼠模型的抑制作用及其机制研究

邢天娇 李东霞 张娟 贾敏鑫

1内蒙古医科大学附属医院皮肤科，呼和浩特010050；2昆明医科大学第一附属医院皮肤科650045

小檗碱是一种异喹啉类季铵生物碱，对多种肿瘤细胞有一定的抑制和杀伤作用，且毒性低、不良反应少，可用于治疗多种癌症［1⁃2］。本课题组前期体外实验［3］已证实，小檗碱具有抑制皮肤鳞状细胞癌（cutaneous squamous cellcarcinoma，cSCC）细胞系A431增殖，促进其凋亡，抑制其迁移的作用。在此基础上，我们建立cSCC⁃A431 裸鼠移植瘤模型，研究小檗碱对cSCC裸鼠移植瘤A431细胞增殖、凋亡的作用，探讨其抗肿瘤作用，为cSCC 治疗提供新线索。

材料与方法

一、细胞株及主要试剂和仪器

BALB/c⁃Foxn1nu雌性裸鼠20 只由南京大学模式动物研究所提供，实验动物合格证号为201808257；本实验在南京米度生物技术有限公司完成，动物使用许可证号为SYXK（苏）2020⁃0016。A431 细胞购自中国科学院细胞库（目录号为TCHu188）。小檗碱粉末（美国Sigma⁃Aldrich公司）溶于蒸馏水，配成浓度为1 g/L。Tunnel 试剂盒（江苏凯基生物技术股份有限公司，货号KGA704），反转录试剂盒（日本TaKaRa 公司，货号RR047A），Ki67 免疫组化试剂盒（丹麦Dako 公司，货号K4003）。RPMI 1640 培养基，ECL 化学发光液（美国ThermoFisher 公司）；兔抗Bcl⁃2 抗体（美国Proteintech Group公司，货号12789⁃1⁃AP）；兔抗Bax抗体、兔抗胱天蛋白酶（caspase）⁃3 抗体、鼠抗埃兹蛋白（Ezrin）抗体、兔抗Ki67 抗体（英国Abcam 公司，货号分别为ab32503、ab44976、ab4069、ab16667）；辣根过氧化物酶（HRP）标记抗兔抗体、HRP抗小鼠抗体（上海碧云天生物技术有限公司，货号分别为A0208、A0216）。StepOne Plus 定量PCR 仪（美国Applied Biosystems公司），Tanon5200化学发光检测系统（上海天能科技有限公司）。

二、实验方法

1.A431 细胞培养：A431 细胞于含10%胎牛血清、100 U/ml青霉素、100 μg/ml链霉素的RPMI 1640培养基中，37 ℃、5%CO2恒温培养箱内培养3 d，胰酶终消化后离心。1个培养皿细胞消化后，接种至3 个培养皿中进行细胞传代培养。A431 细胞生长至80% ～90%时胰酶消化、离心，弃上清液，加培养基重悬后进行细胞扩大培养。胰酶消化，加磷酸盐缓冲液（PBS）重悬，计数细胞，将密度调整至5×107个/ml。

2. cSCC⁃A431 裸鼠移植瘤模型的建立和分组处理：20只8周龄雌性裸鼠适应性饲养7 d，自由摄食，室温26 ℃～28 ℃，相对湿度40%～50%。饲养7 d后，于每只裸鼠右背部皮下缓慢注射5×107个/ml细胞悬液100 μl，建立cSCC⁃A431 裸鼠移植瘤模型。接种第15天，肿瘤直径约4 mm，将裸鼠随机分为小檗碱低、中、高剂量组和对照组，每组5只，低、中、高剂量组分别于腹腔注射10、20、25 mg/kg小檗碱溶液，对照组注射等量生理氯化钠溶液，每日1 次，连续给药35 d，药物剂量的确定参考预实验及文献［4］。分别于给药前、给药第7、14、21、28、35 d，采用LINKS 哈量电子游标卡尺测量肿瘤的最长径（a，cm）与最短径（b，cm），肿瘤体积（V，cm3）= a ×b2/2，并绘制体积变化曲线。35 d 实验结束后处死裸鼠，取材，拍照后冻存。

3.标本收集：处死裸鼠后随即手术剥离瘤块称重，肿瘤生长抑制率=［（对照组平均瘤重－治疗组平均瘤重）/对照组平均瘤重］×100%。

4.瘤体组织病理检查：4%甲醛溶液固定剥离的瘤体组织，制成石蜡切片，HE染色，光镜观察。

5.免疫组化检测小檗碱作用后移植瘤组织中Ki67 蛋白的表达：各组石蜡切片常规脱蜡脱水，PBS 冲洗3 次，置EDTA 缓冲液中微波修复，PBS 冲洗5 min 3 次；3%过氧化氢甲醇溶液阻断内源性过氧化物酶10 min；PBS冲洗5 min 3次，甩干后5%牛血清白蛋白（BSA）封闭20 min；弃BSA 液，滴加50 μl 稀释的兔抗Ki67 抗体，4 ℃下过夜，PBS 冲洗5 min 3 次。去除PBS 液，滴加50 ～100 μl 抗兔二抗，4 ℃孵育过夜，PBS冲洗5 min 3次；二氨基联苯胺（DAB）溶液显色，自来水冲洗，苏木素复染，脱水封片。光镜观察，染色为棕色细胞代表Ki67阳性，分别计数3 个200 倍视野Ki67 阳性细胞数并计算平均数，采用双盲法判定计数，2 位有经验的病理医师反复核对。

6.TUNNEL染色检测移植瘤组织中细胞凋亡：石蜡切片脱蜡至水，依次加入二甲苯Ⅰ15 min、二甲苯Ⅱ15 min、浓度梯度100%、85%、75%乙醇3 min，蒸馏水洗；接着加入蛋白酶K工作液在室温下孵育30 min，PBS 洗片3 次，每次5 min；滴加TUNNEL 试剂盒内适量试剂1 末端脱氧核苷酸转移酶（TdT）和试剂2 脱氧尿苷三磷酸（dUTP）按2∶29混合，37 ℃湿盒孵育2 h；PBS冲洗5 min 3次；滴加3%过氧化氢甲醇溶液，室温避光孵育15 min；甩干切片，滴加适量荧光素抗体converter⁃POD，37 ℃温箱孵育30 min，PBS 冲洗5 min 3 次；甩干后滴DAB显色液，自来水冲洗切片终止显色；苏木素复染3 min，自来水冲洗，1%盐酸乙醇分化数秒，自来水冲洗，氨水返蓝，流水冲洗；最后用梯度乙醇脱水、二甲苯透明、中性树胶封片。显微镜下拍照，采用上述免疫组化方法计数，棕黄色细胞核代表凋亡细胞，分别计数3 个200 倍视野凋亡细胞数并计算平均数。

7.荧光定量PCR 检测cSCC⁃A431 裸鼠移植瘤中Bax、Bcl⁃2、caspase⁃3、Ezrin mRNA 相对表达量：采用Trizol 法提取移植瘤组织总RNA，按反转录试剂盒说明书将RNA 反转录成cDNA，引物序列见表1。按荧光定量PCR试剂盒说明书配制溶液，反应体系为cDNA 2.0 μl、正反向引物各0.4 μl、SYBR Green solution 10.0 μl、灭菌双蒸水7.2 μl，总量为20 μl；预变性95 ℃10 min；变性95 ℃5 s、退火、延伸60 ℃1 min，共40 个循环。采集数据进行分析，△Ct = Ct目的基因－Ct内参基因，△△Ct = △Ct小檗碱组－△Ct对照组，以2-△△Ct计算各基因mRNA相对表达。

8.Western 印迹法测定cSCC⁃A431裸鼠移植瘤中Bax、Bcl⁃2、caspase⁃3、Ezrin 蛋白的表达量：液氮研磨各组肿瘤组织，冰上裂解，提取组织中总蛋白，用二喹啉甲酸（BCA）试剂盒进行蛋白定量。30 mg蛋白溶液中加入5×SDS 上样缓冲液，至沸水中煮5 min，加足量电泳液，于浓缩胶中60 V 电泳30 min，样品进入分离胶后，改用80 V电泳90 min。电泳至溴酚蓝刚跑出即可终止电泳，然后转移至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上，5%脱脂奶粉室温封闭1 h；采用含5% BSA 的TBST 溶液按1∶1 000 稀释Bax、Bcl⁃2、caspase⁃3、Ezrin 一抗，4 ℃孵育过夜，TBST洗膜10 min 3次；加1∶5 000 TBST溶液稀释的二抗（HRP 抗小鼠抗体、HRP 抗兔抗体）室温孵育2 h；TBST洗膜3次后，ECL化学发光，Tanon凝胶成像仪拍照，各蛋白的相对表达量为各蛋白灰度值与内参GAPDH灰度值的比值。

基因名称Bax Bcl⁃2胱天蛋白酶3埃滋蛋白甘油醛-3-磷酸脱氢酶正向引物（5′→3′）序列GGATGCGTCCACCAAGAA GAACATTTCGGTGACTTCCG GACTGGAAAGCCGAAACTCT AGAGACGGTGGAGAGAGAAA GTGGCAAAGTGGAGATTGTTG Tm（℃）54.7 54.2 54.8 54.4 54.9反向引物（5′→3′）序列CATCCTCTGCAGCTCCATATT CCTGTTGATCATCCCTGGAG GTATCTTCTGGCAAGCCATCT CTTGGTCTTCTGCTCGTAGTC CGTTGAATTTGCCGTGAGTG Tm（℃）54.4 54.3 54.6 55.0 55.4

三、统计学处理

结果

一、小檗碱抑制cSCC⁃A431裸鼠移植瘤的生长

4 组cSCC 裸鼠肿瘤生长曲线见图1。随小檗碱剂量升高和作用时间延长，肿瘤生长曲线逐渐变平缓。与对照组相比，各小檗碱组肿瘤生长受到不同程度的抑制，其中高剂量组肿瘤生长抑制作用最明显。用药第35 天，低、中、高剂量组瘤体积显著低于对照组（t = 3.08、6.81、7.38，均P < 0.01），见表2。4 组移植瘤重量差异有统计学意义（P <0.01），且各小檗碱组瘤重均显著低于对照组（t =4.07、6.33、7.26，均P<0.01）。见图2、表2。小檗碱低、中、高剂量组肿瘤生长抑制率分别为31.05%、66.68%、76.49%。

二、不同剂量小檗碱处理后cSCC⁃A431裸鼠移植瘤的组织病理表现

对照组cSCC⁃A431 裸鼠移植瘤组织见大量鳞状细胞肿瘤团块，细胞异形性明显，可见核分裂相及瘤巨细胞，细胞间桥消失，肿瘤细胞无坏死或少量点状坏死（图3）；小檗碱低剂量组肿瘤细胞团间坏死灶较分散，呈点状分布，中剂量组肿瘤细胞团之间可见灶性坏死区域，高剂量组肿瘤细胞团之间出现大片状坏死（图3）。高剂量组肿瘤坏死的范围、程度最大。

三、免疫组化法检测不同剂量小檗碱处理后cSCC⁃A431裸鼠移植瘤中Ki67蛋白的表达

瘤体积（mm3）697.48±107.49 480.91±139.57a 218.80±116.45a 179.11±69.14a 23.84<0.01瘤重（g）0.55±0.15 0.31±0.06a 0.18±0.07a 0.13±0.05a 20.91<0.01 Ki67阳性细胞数（200倍视野）93.33±7.09 67.33±5.69a 34.33±7.02a 23.00±5.29a 76.79<0.01组别对照组小檗碱低剂量组小檗碱中剂量组小檗碱高剂量组F值P值凋亡细胞数（200倍视野）17.33±4.73 27.67±3.79b 39.00±3.00a 41.67±3.06a 27.27<0.01

对照组可见大量表达Ki67 的棕色A431 细胞，而加入小檗碱处理后，随剂量增加，Ki67 阳性细胞减少。见图4。小檗碱低、中、高剂量组Ki67 阳性细胞数均显著低于对照组（t=5.03、11.43、13.62，均P<0.01），见表2。

四、TUNNEL 法检测小檗碱处理后cSCC⁃A431裸鼠移植瘤中细胞凋亡

对照组瘤组织中棕黄色阳性细胞少，染色浅；而加入小檗碱处理后，随其剂量增加，凋亡细胞逐渐增多，染色深。见图5。小檗碱低、中、高剂量组凋亡细胞数均显著高于对照组（t=3.41、7.16、8.04，P<0.05或<0.01），见表2。

五、荧光定量PCR检测小檗碱对cSCC⁃A431裸鼠移植瘤中Bax、Bcl⁃2、caspase⁃3、Ezrin mRNA表达的影响

组别mRNA相对表达（2-△△Ct）Bax 1.00±0.00 1.25±0.36 1.66±0.40 2.38±0.33a 10.96<0.01 Bcl⁃2 1.00±0.00 0.74±0.05a 0.50±0.01a 0.36±0.06a 146.39<0.01 caspase⁃3 1.00±0.00 1.35±0.07 2.01±0.19b 2.86±0.72a 14.12<0.01 Ezrin 1.00±0.00 1.20±0.32 1.46±0.24 2.33±0.07a 25.01<0.01对照组小檗碱低剂量组小檗碱中剂量组小檗碱高剂量组F值P值蛋白相对表达（以GAPDH为内参）Bax 0.33±0.06 0.59±0.06a 0.93±0.09a 1.01±0.06a 59.60<0.01 Bcl⁃2 1.02±0.03 0.90±0.03 0.64±0.08a 0.42±0.12a 34.81<0.01 caspase⁃3 0.29±0.05 0.61±0.07a 0.93±0.07a 0.98±0.09a 59.02<0.01 Ezrin 1.02±0.07 0.76±0.06a 0.55±0.03a 0.39±0.05a 74.58<0.01

4 组Bax、Bcl⁃2、caspase⁃3、Ezrin mRNA 的表达差异均有统计学意义（均P < 0.01）。见表3。其中，小檗碱高剂量组Bax和Ezrin mRNA表达显著高于对照组（t=5.36、8.02，均P<0.01），而小檗碱低、中剂量组与对照组比较差异无统计学意义（均P>0.05）。小檗碱中、高剂量组caspase⁃3 mRNA的表达均显著高于对照组（t = 3.30、6.04，P < 0.05或<0.01），而小檗碱低剂量组与对照组差异无统计学意义（P>0.05）。此外，小檗碱低、中、高剂量组Bcl⁃2 mRNA 的表达均显著低于对照组（t = 7.76、15.20、19.43，均P<0.01）。

六、Western 印迹法测定不同剂量小檗碱处理后cSCC⁃A431 裸鼠移植瘤组织中Bax、Bcl⁃2、caspase⁃3、Ezrin蛋白的表达

随小檗碱剂量的增加，Bax、caspase⁃3蛋白表达逐渐增加，而Bcl⁃2 蛋白、Ezrin 蛋白表达逐渐降低。见图6、表3。小檗碱低、中、高剂量组Bax、caspase⁃3 蛋白表达量均显著高于对照组（Bax：t =4.37、10.32、11.80；caspase⁃3：t=5.41、10.87、11.69；均P<0.01），而Ezrin 蛋白的表达均显著低于对照组（t = 5.88、10.67、14.06，均P < 0.01）；小檗碱中、高剂量组Bcl⁃2 蛋白的表达均显著低于对照组（t=5.86、9.34，均P<0.01），而小檗碱低剂量组与对照组差异无统计学意义（P>0.05）。

讨论

近年小檗碱的抗肿瘤作用在多种肿瘤研究中获较大突破。本研究采用cSCC A431 细胞裸鼠移植瘤模型探究小檗碱抗cSCC 机制。与对照组相比，10、20、25 mg/kg 小檗碱对cSCC⁃A431 移植瘤生长均有不同程度的抑制作用，随小檗碱剂量的增加，移植瘤生长逐渐变缓，肿瘤生长抑制率增高。组织病理检查显示，随小檗碱剂量的增加，肿瘤细胞坏死逐渐增多，高剂量组肿瘤细胞坏死面积更广泛。Ki67与细胞有丝分裂相关，在增殖活跃的肿瘤细胞中高表达，因此常作为多种肿瘤细胞增殖的标志物［5］。免疫组化显示，随小檗碱剂量的增加，Ki67表达逐渐降低，提示小檗碱可抑制cSCC⁃A431移植瘤细胞增殖。TUNNEL实验显示，低、中、高剂量小檗碱均能促进cSCC⁃A431 移植瘤细胞凋亡。本文结果与前期小檗碱对A431 体外研究结果相符［3］。

恶性肿瘤的发生、发展与诸多因素相关，细胞凋亡能力的异常降低与增殖能力的异常增强是其关键因素之一，而小檗碱与多种恶性肿瘤细胞的凋亡与增殖有关［6］。Bcl⁃2 和Bax 是细胞凋亡研究中最受重视的2 个癌基因，其中大多数Bcl⁃2 家族蛋白位于哺乳动物的线粒体外膜上，可通过调节线粒体通透性来调控细胞凋亡［7］。Bax 作为Bcl⁃2 家族成员之一，其生理作用与Bcl⁃2相反，表现为促进细胞凋亡［8］。caspase 是细胞程序性死亡信号网的重要部分，细胞凋亡过程中caspase⁃3 的激活受上游Bcl⁃2因子调控，而小檗碱可诱导Bcl⁃2家族成员活化，导致线粒体膜电位及通透性改变，促使相关蛋白酶活化，使线粒体释放细胞色素C 等，导致caspase 级联反应激活，尤其激活反应关键酶caspase⁃3，从而引发凋亡［9⁃10］。本研究显示，低、中、高剂量小檗碱处理后cSCC⁃A431 裸鼠移植瘤中凋亡相关蛋白Bax、caspase⁃3 mRNA 和蛋白相对表达有不同程度的增加，而Bcl⁃2 mRNA 和蛋白相对表达有不同程度的降低，其中小檗碱高剂量组Bax、caspase⁃3、Bcl⁃2 mRNA 和蛋白相对表达与对照组差异均有统计学意义。

Ezrin 蛋白具有参与细胞膜的连接，维持细胞形态，调节细胞运动等，且与肿瘤的侵袭与转移密切相关［11］。Ezrin蛋白作为连接细胞膜与细胞骨架的重要分子，通过相应氨基酸载体与Fas 结合［12］，使Ezrin 蛋白从细胞膜易位到细胞质中，同时伴随Ezrin蛋白的去磷酸化［13］，导致Ezrin蛋白失活，最终诱发凋亡［14］。本研究中，小檗碱高剂量组Ezrin mRNA相对表达显著高于对照组，而低、中、高剂量组Ezrin蛋白表达却显著低于对照组。Ezrin mRNA表达结果与预期不同，且与其蛋白表达结果不一致，分析其原因：①mRNA 转录、加工、翻译形成蛋白过程复杂，中间微小环节偏差均可导致结果不同；②转录与翻译存在时间间隔，检测时间点不同，转录水平与翻译水平可能存在差异；③mRNA是单链结构，相对不稳定，且荧光定量PCR灵敏度高，应进一步增加实验次数以排除实验误差。

综上所述，小檗碱通过抑制cSCC⁃A431移植瘤细胞的增殖，促进细胞凋亡，进而有效抑制cSCC⁃A431移植瘤生长，其机制可能与小檗碱下调Bcl⁃2、Ezrin表达，同时上调Bax、caspase⁃3的表达有关。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突