量子点荧光猝灭免疫亲和凝胶检测柱检测番茄酱中罗丹明B的研究

胡高爽,高 山,*,韩 雪,王 君,李 娜

(1.河北科技大学生物科学与工程学院,河北石家庄 050000;2.沧州师范学院生命科学学院,河北沧州 061000;3.河北英茂生物科技有限公司,河北石家庄 050000)

罗丹明B(Rhodamine B)又名玫瑰红B,分子式为C28H31ClN2O3,是一种人工合成的碱性荧光染料。根据国际癌症研究署(IARC)化学品致癌风险评估表明,罗丹明B具有强烈的“三致”(致癌、致畸、致突变)风险[1-3]。国家卫生部门在食品整治办(2008)3号文件“关于印发《食品中可能违法添加的非食用物质和易滥用的食品添加剂品种名单(第一批)》的通知”中,将罗丹明B纳入首批可能违法添加的非食用物质,严禁在食品中添加[4]。

目前针对罗丹明B检测的方法有很多种,主要包括光谱法[5]、高效液相色谱法(high-performance liquid chromatography,HPLC)[6-9]、液相色谱-质谱联用法(liquid chromatography-mass spectrometry,LC-MS)[10-13]等。然而这些检测方法需要昂贵的仪器设备、检测过程繁琐耗时较长,无法实现现场快速检测。基于抗原-抗体特异性结合反应的免疫学方法,具有快速灵敏、特异性强,实际操作简便等优点[14-16],其中免疫亲和凝胶检测柱是基于免疫亲和检测法发展起来的一种可视化快速检测方法。但是,传统的免疫分析技术大多采用酶蛋白作为标记物,容易受到基质的影响,繁琐的样品前处理过程阻碍了实验方法灵敏度的提升。

近年来,荧光技术得到了国内外科研工作者的广泛关注,并逐渐应用于免疫分析技术中[17-19]。荧光共振能量转移(fluorescence resonance energy transfer,FRET)是一种两个相互靠近的供体与受体通过偶极子-偶极子相互作用而产生的非辐射性的过程,其中荧光猝灭是荧光能量共振转移导致现象之一[20-22]。本研究旨在建立一种基于量子点的荧光猝灭免疫亲和凝胶检测柱方法,并将其应用于番茄酱中罗丹明B的快速分析检测。该方法基于荧光供体(羧基化量子点,最大发射波长为532 nm)与荧光受体(罗丹明B,最大吸收波长为554 nm,最大的荧光波长为610 nm)发生荧光共振能量转移导致荧光猝灭的现象,结合免疫亲和凝胶检测柱的特异性识别作用,以实现番茄酱中罗丹明B的快速分析检测,可用于番茄酱中罗丹明B的现场快速检测。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

溴化氢活化琼脂糖凝胶-4B、甘氨酸(Glycine) 分析纯,美国Sigma公司;盐酸、氯化钠、碳酸氢钠、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、无水乙酸钠均 分析纯,国药集团化学试剂有限公司;罗丹明B单克隆抗体 山东绿都生物科技有限公司;羧基化ZnCdSe/ZnS量子点(最大发射波长532 nm) 武汉珈源量子点技术开发有限公司;亨氏番茄酱样品 当地超市。

Shimadzu UV-2300紫外分光光度计 日本Shimadzu公司;F-4500荧光光谱仪 日本Hitachi公司;四用暗箱紫外分析仪 上海勤科分析仪器有限公司;高效液相色谱仪、waters C18色谱柱(4.6 mm×250 mm,5 μm) 美国waters公司。

1.2 实验方法

1.2.1 罗丹明B分析物抗体胶的制备 将罗丹明B抗体与溴化氢活化的琼脂糖凝胶偶联制备罗丹明B分析物抗体胶,具体偶联的过程如下[23-25]:1.0 g的溴化氢活化琼脂糖凝胶与80 mL 1 mmol/L HCl溶液混合搅拌均匀并放置溶胀10 min;将溶胀好的凝胶转移到具砂板层析柱中,稳定后再用200 mL HCl溶液对琼脂糖凝胶进行淋洗。取10 mL偶联缓冲液(2.92 g NaCl,0.84 g NaHCO3,加入100 mL双蒸水,用NaOH调pH至8.3),分三次倒入层析柱中,将琼脂糖凝胶体系调节至中性。取适量罗丹明B单克隆抗体(4 mg/mL)用缓冲液稀释后加入到具砂板层析柱中,室温条件下振荡反应2 h。反应时间结束后,再进行三次冲洗。随后加入10 mL的甘氨酸封闭液(0.3 g甘氨酸加入到10 mL的偶联缓冲液中)进行封闭,室温下连续振荡反应2 h。反应结束后,用已配好的醋酸钠缓冲液(2.92 g NaCl,0.58 mL CH3COOH,加入100 mL双蒸水溶解,再用无水乙酸钠调pH至4.0)和偶联缓冲液各10 mL依次倒入具砂板层析柱中对琼脂糖凝胶进行冲洗,此步骤重复三次,待缓冲液全部自然流出后,抽空琼脂糖凝胶中的清洗液,用磷酸盐缓冲液将制备好的封闭胶悬起,放置于冰箱中4 ℃保存,以备后续实验操作的正常使用。

1.2.2 罗丹明B荧光猝灭免疫亲和凝胶检测柱的组装和检测 罗丹明B荧光猝灭免疫亲和凝胶检测柱只由单层检测层组成的,取一个聚乙烯垫片放入1 mL的塑料柱,然后在塑料柱中加入150 μL混匀混合的分析物抗体胶,注射器置于塑料柱上加压将其中所带的磷酸盐缓冲液压出,塑料管中剩余的浓缩分析物抗体胶即为荧光猝灭免疫亲和凝胶检测柱的检测层。在检测柱中放入第二片聚乙烯垫片,如图1所示,将其压至分析物抗体胶的上面,使分析物抗体胶上下分别被两垫片固定住。在检测柱中加入含有罗丹明B的样品溶液,用注射器加压,将磷酸盐缓冲液继续压出,然后加入50 μL制备好的一定稀释倍数的ZnCdSe/ZnS量子点溶液,通过注射器施加压力使加入的量子点溶液完全侵入检测柱分析物抗体凝胶中,即可完成罗丹明B荧光猝灭免疫亲和凝胶检测柱的组装和检测,通过观察检测层荧光强度的变化实现对罗丹明B的快速分析检测。

1.2.3 实际样品检测 样品前处理的方法参考先前的文献并做了进一步的改进[26-27],取1 g番茄酱样品,分别添加一系列浓度的罗丹明B(5.0、10.0和20.0 μg/kg),加入1 mL水,混合均匀,加入4 mL乙腈,剧烈振荡30 s,使罗丹明B充分溶解;再加入5 mL正乙烷,剧烈振荡5 min,除去体系中存在的脂肪等干扰;离心至上下分层明显后,取出1 mL乙腈相并用氮气吹干,用1 mL PBS复溶,然后用所构建的罗丹明B荧光猝灭免疫亲和凝胶检测柱进行测定。

1.2.4 HPLC分析 为了验证方法的实用性和准确性,参考SN/T 2430-2010 《进出口食品中罗丹明B的检测方法》中的高效液相色谱检测方法进行验证。称取2.0 g样品于50 mL离心管中,准确加入25 mL乙酸乙酯-环己烷溶液(1∶1,体积比),于旋涡混匀器上混合提取2 min,再超声提取15 min后,于4000 r/min离心5 min,上清液过0.22 μm微孔滤膜后作待净化液。HPLC分析条件:色谱柱:Waters C184.6 mm×250 mm,5 μm;激发波长:550 nm 发射波长580 nm;流动相:A(甲醇)∶B(水)4∶1 (v/v);流速1.0 mL/min,进样体积20 μL;柱温:35 ℃。

1.3 数据处理

实验采用SPSS 18.0统计软件和Excel 2013软件进行统计学分析,数据均用平均数±标准差(Means±SD)表示。

2 结果与分析

2.1 罗丹明B量子点荧光猝灭免疫亲和凝胶检测柱原理

本研究基于抗原抗体特异性结合反应和荧光共振能量转移的原理,建立了一种针对番茄酱中非法着色剂罗丹明B进行快速检测的荧光猝灭免疫亲和凝胶检测柱方法,其原理如图1所示。首先将特异性识别罗丹明B的单克隆抗体与溴化氢活化琼脂糖凝胶-4B偶联制备检测柱的检测层。当加入含有罗丹明B样品时,罗丹明B就被抗体特异性的吸附到检测层。再向体系中加入适量的羧基化ZnCdSe/ZnS量子点,这时由于量子点表面富含羧基,羧基为阴离子,带有负电荷,罗丹明B是带有正电荷的杂环碱性染料,两者之间能够通过静电引力的相互作用紧密结合在一起,满足荧光共振能量转移的对距离的要求。同时ZnCdSe/ZnS量子点的最大荧光发射波长(532 nm)与罗丹明B最大吸收波长(554 nm)发生重叠,能够满足荧光共振能量转移的光谱重叠的要求。这时量子点与罗丹明B发生荧光共振能量转移,出现量子点(绿色荧光)荧光猝灭而罗丹明B荧光(红色荧光)增强的现象。样品中罗丹明B含量越多,与抗体特异性结合越多,在检测层中与量子点溶液发生荧光猝灭越明显,检测层观察到的量子点(绿色荧光)荧光猝灭而罗丹明B荧光(红色荧光)增强现象越明显。本研究根据检测层中荧光亮度变化为本实验的检测指标,当检测层中的绿色荧光发生明显变化,此时对应的浓度确立为罗丹明B的检测限。

图1 罗丹明B量子点荧光猝灭免疫亲和凝胶检测柱原理图

2.2 量子点荧光猝灭免疫亲和凝胶检测柱条件优化

2.2.1 分析物抗体胶中抗体量的确定 在制备分析物抗体胶的过程中,抗体添加量过少或过多,抗原抗体的特异性结合会受到影响,结合到分析胶上的抗体越多,检测层富集分析物的能力越强,因此在相同荧光强度下方法的灵敏度也就越高。然而,抗体添加量过多,不仅会导致实验成本的提高,而且过多的抗体会导致凝胶上抗体蛋白分布不均或自聚集影响实验结果的稳定性。因此,分析物抗体胶制备过程中抗体添加量是非常重要的因素。分别取不同量的罗丹明B单克隆抗体(0、1.0、2.0和3.0 mg)与固定量1.0 g的溴化氢活化的琼脂糖凝胶发生偶联反应制备检测层,固定罗丹明B添加浓度(3.0 μg/L)、上样体积(1.0 mL)以及量子点浓度(稀释3000倍)等其他条件,按上述实验方法进行样品操作,在紫外分析仪365 nm的UV光照下,选择导致荧光强度明显变化的最小抗体添加量作为抗体胶中最佳抗体量。结果如图2所示,2.0 mg罗丹明B单克隆抗体与1.0 g的琼脂糖凝胶结合,检测层中的绿色荧光完全消失,荧光淬灭现象明显。因此,选择2.0 mg罗丹明B单克隆抗体(每1.0 g溴化氢活化的琼脂糖凝胶)为分析物抗体胶中抗体量的最优值。

图2 分析物抗体胶中抗体量的优化

2.2.2 量子点稀释倍数的确定 量子点稀释倍数对检测体系的灵敏度也有重要影响。若稀释倍数过大,量子点浓度小则荧光亮度较低,不易观察;若溶液稀释倍数太小,荧光亮度过大,则荧光猝灭效应不易发生。本研究中,ZnCdSe/ZnS量子点原溶液浓度为8 μmoL/L,实验中用磷酸盐缓冲液将量子点溶液分别稀释1000、2000、3000和4000倍,用优化好的抗体胶、固定体积(1.0 mL)和固定浓度(3.0 μg/L)的罗丹明B溶液,按上述实验方法操作,选择能够导致检测层中荧光猝灭的最小稀释倍数作为最佳稀释倍数。在紫外分析仪365 nm的UV光照下,各个检测柱的结果如图3所示,当量子点溶液稀释3000倍时检测柱中荧光亮度发生猝灭效果最好。

图3 量子点稀释倍数的优化

2.2.3 孵育时间的确定 实验中分析物与抗体孵育时间的长短直接影响抗原抗体结合与非特异性吸附程度,适当的孵育时间可以确保分析物和抗体之间的特异性识别和结合,减少非特异性吸附作用,从而提高检测的灵敏度。因此,需要对反应时间进行优化。按上述实验方法,以1.0 mL罗丹明B(浓度为3.0 μg/L)上样量为基准,在检测柱中加入罗丹明B溶液并加压使其流至检测层时,开始计算孵育时间,时间分别控制为30、40、50、60、70 s,实验结束后,在紫外分析仪365 nm的UV光照下观察。结果如表1所示,当孵育时间过少时,罗丹明B与抗体反应不充分,猝灭效应不明显,检测层中的荧光亮度过强;当反应时间过长时,则会出现非特异性吸附过强的现象,导致检测层中的荧光梯度变差。因此,1.0 mL罗丹明B上样体积孵育时间控制在50 s时,反应较为充分,检测层的绿色荧光猝灭现象明显。

表1 孵育时间的确定

2.2.4 上样体积的确定 在实验中,对检测柱中的罗丹明B的添加量进行优化,确定其最佳值。对实验中除上样体积之外的条件进行固定,对罗丹明B(浓度为1.0 μg/L)的加入量分别控制在1.0、2.0、3.0、4.0 mL,按照上述实验方法进行操作,在紫外分析仪365 nm的UV光照下观察。在罗丹明B的加入量为3.0 mL的条件下,检测层中的猝灭现象显色效果明显。若罗丹明B上样量不足,则检测层中与量子点的荧光猝灭反应不完全,梯度也不好,影响实验结果的准确性;若罗丹明B上样量过大,荧光猝灭现象也比较明显,但会造成实验成本浪费检测梯度变差,故确定3.0 mL为罗丹明B上样量的最优值,结果见表2。

表2 上样体积的确定

2.3 罗丹明B荧光猝灭免疫亲和凝胶检测柱检测限的确定

将罗丹明B溶液配制成不同的浓度梯度,分别为0、1.0、2.0、5.0 μg/L,在其他实验因素均固定且处于最优值的条件下,对各个浓度的罗丹明B溶液进行检测。在检测柱中,绿色荧光亮度发生猝灭现象时罗丹明B浓度最低值即为本方法针对罗丹明B的检测限。结果如图4所示,在罗丹明B浓度为1.0 μg/L时,检测柱出现明显的绿色荧光猝灭现象,即本方法针对罗丹明B的检测限为1.0 μg/L。

图4 罗丹明B荧光猝灭免疫亲和凝胶检测柱检测限的确定

2.4 样品分析

为了验证方法的实用性和准确性,将所建立的基于量子点的荧光猝灭免疫亲和凝胶检测柱与高效液相色谱方法测定的结果进行比较。结果如表3所示,两种检测结果显示出较好的一致性,说明所建立的方法具有很好的实用性。此外,当用所建立的方法测定添加量小于5.0 μg/kg的样品,检测层没有出现明显的绿色荧光淬灭现象,证明该方法的样品检测限为5.0 μg/kg。

表3 高效液相色谱法和本研究所提出方法检测番茄酱中罗丹明B(n=3)

3 结论

本研究利用荧光共振能量转移的原理建立了一种针对番茄酱中罗丹明B快速检测的荧光猝灭免疫亲和凝胶检测柱方法。在最佳优化实验条件下,方法针对罗丹明B的检测限为1.0 μg/L,样品检测限为5.0 μg/kg,且将所建立的方法与高效液相色谱的方法进行对比,二者具有很好的一致性。该方法检测灵敏度高,检测速度快,非常适用于现场检测。本研究能够为番茄酱中违禁添加物罗丹明B的快速分析检测提供新思路。