金鲳鱼加工副产物中碱溶性蛋白的提取及性质测定

于淑池,卓珊珊,徐云升,薛长风,裴志胜

(1.海南热带海洋学院食品科学与工程学院,海南三亚 572022;2.海洋食品精深加工关键技术省部共建协同创新中心,海南三亚 572022;3.海南省院士工作站(海洋食品),海南三亚 572022)

金鲳鱼(Trachinotusovatus)学名卵形鲳鲹,属硬骨鱼纲、鲈形目、鯵科、鲳鲹属[1],是我国南方沿海重要的海产经济鱼类之一[2]。2016年产量约15万吨[3],全国金鲳鱼年产值将近达100亿元[1];其体形较大,肉质细嫩,无肌间刺,是加工鱼块的优良材料[4],2005年以来,金鲳鱼的加工制品产量占金鲳鱼总产量的50%～80%[5]。水产品在加工的过程中将会产生鱼头、鱼骨、鱼鳍、鱼皮、鱼鳞、鱼尾、内脏等加工副产物,一般占鱼体总重的20%～40%,部分鱼的废弃物甚至达到总重的70%[6];如果不加以合理利用,将造成资源的极大浪费[7],对生态环境产生一定污染;加工副产物中蛋白质主要分为碱溶性蛋白和碱不溶蛋白[8],其中碱溶性蛋白约占5%～10%[9],以肌原纤维蛋白为主,具有较高的营养价值和良好的功能性[8],并具有优异的吸水性、乳化性,不易产生沉淀,溶解性好,易吸收的特点[10],目前金鲳鱼加工副产物的加工利用的相关研究仅见于淑池等[11]从金鲳鱼骨中提取明胶的工艺,曹璇等[12]利用超声辅助稀碱水解法提取金鲳鱼骨油,未见从金鲳鱼加工副产物中提取碱溶性蛋白的报道。

在食品工业中鱼类加工副产物最有效的处理方法是酶解法,蛋白酶酶解提取蛋白一直是国内外的研究热点[13]。酶解得到的蛋白产品虽然有较高的营养价值,但是它的功能性质和风味略差,特别是有较重的腥味且容易吸潮[14];碱提法具有工艺简单、提取率高[15]、生产成本较低等优点,成为提取碱溶性蛋白的主要方法[16],但高浓度碱溶液提取的蛋白,风味会受影响,蛋白色泽变深,营养价值受损失,纯度会下降[17],基于节约成本和工业化生产可行性考虑,本研究采用弱碱法对碱溶性蛋白质进行提取,最大限度避免pH过高的不良反应,为金鲳鱼加工副产物的加工利用提供参考。

本研究采用碱提法对金鲳鱼加工副产物中碱溶性蛋白的最佳提取工艺进行研究,并对碱溶性蛋白的性质进行测定，以期提高金鲳鱼加工的附加值,使金鲳鱼加工副产物变废为宝,同时保护环境,还可为优质蛋白的来源提供新途径。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

新鲜金鲳鱼(800±20 g) 购买于三亚市胜利路旺豪超市;甲醇、95%乙醇、冰醋酸、氢氧化钠 分析纯,西陇科学股份有限公司;乙酸镁 分析纯,天津市大茂化学试剂厂;硫酸铜、硫酸钾 分析纯,成都金山化学试剂有限公司;溴酚蓝 Aladdin有限公司;十二烷基硫酸钠、过硫酸铵、四甲基乙二胺(TEMED)、考马斯亮蓝R-250、考马斯亮蓝G-250、Tris-HCl(pH=8.8)缓冲溶液、Tris-HCl(pH=6.8)缓冲溶液(分析纯)、彩虹245广谱蛋白Maker(电泳级) 北京索莱宝有限公司;丙烯酰胺 电泳级,Aladdin有限公司;盐酸 优级纯,开封中天化工有限公司;17种氨基酸混合溶液标准物质 优级纯,中国计量科学研究院。

HWS-26超级恒温水浴槽 金坛市盛蓝仪器制造有限公司;PTHW电热套 巩义市予华仪器责任有限公司;SHB-B95循环水式多用真空泵 郑州长城贸有限公司;ME204E/02电子天平 梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司;LT-DBX120F精密可编程热风循环烘箱 立德泰勀(上海)科学仪器有限公司;XHF-DY高速分散器 宁波新芝生物股份有限公司;PB-10pH计 赛多利斯科学仪器(北京)有限公司;RS-FS1401多功能粉碎机 合肥荣事达小家电有限公司;HLX-12B马弗炉 洛阳恒立窑炉有限公司;Pilot-12E真空冷冻干燥机 北京博医康实验仪器有限公司;T6新世纪紫外可见分光光度计 北京普析通用仪器有限责任公司;TC-8FTAITEC型日本试管浓缩仪 北京安捷来勒科技有限公司;A300氨基酸自动分析仪 德国曼默博尔青岛技术服务中心;Multifuge X1R高速冷冻离心机 塞默飞世科技中国有限公司;PowerPac Basic型电泳电压仪 美国Bio-Rad公司;GelDoc-It&ChemiDoc-It型电泳成像系统 德国Jean分析仪器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 金鲳鱼加工副产物中碱溶性蛋白提取的工艺流程 金鲳鱼→预处理(去鱼肉、内脏)→加工副产物(鱼头、鱼骨、鱼鳍)→清洗→60 ℃烘干→粉碎过60目筛→碱液浸提→冷冻离心(4 ℃、5000×g、20 min)→取上清液→盐酸调节pH沉淀(pH4.6)→第二次冷冻离心→蒸馏水洗至中性→真空冷冻干燥(-40 ℃、10 Pa压力冷冻干燥8 h)→碱溶性蛋白成品。

1.2.2 金鲳鱼加工副产物基本成分测定 对金鲳鱼加工副产物干粉的粗脂肪、粗蛋白、水分、总灰分等基本成分进行测定。粗脂肪测定按照国标GB 5009.6-2016[18]的索氏提取法;粗蛋白测定按照国标GB 5009.5-2016[19]的凯氏定氮法;水分测定按照国标GB 5009.3-2016[20]的直接干燥法;总灰分测定按照国标GB 5009.4-2016[21]的第一法。

1.2.3 碱溶性蛋白等电点的测定 通过碱提酸沉法确定碱溶性蛋白的等电点。具体操作为:金鲳鱼加工副产物干粉以料液比1∶10 g/mL,采用0.3 mol/L NaOH溶液浸提,温度50 ℃保持60 min;经过冷冻离心(4 ℃、5000×g、20 min)得上清液,用0.05 mol/L HCl溶液,调整pH到2.6～5.6范围,使上清液中大多数蛋白质聚集沉淀,再将其于4 ℃条件下静置30 min后再离心,用蒸馏水水洗至中性,即得到碱溶性蛋白质,计算碱溶性蛋白沉淀率(公式1),沉淀率达到最大时的pH即为等电点。

碱溶性蛋白沉淀率(%)=沉淀得到的蛋白质质量/原料中蛋白质质量×100

式(1)

1.2.4 金鲳鱼加工副产物中碱溶性蛋白提取的单因素及正交试验设计 采用NaOH溶液作为提取液,固定酸沉pH4.6,初步固定NaOH浓度为0.3 mol/L、料液比为1∶10 g/mL、提取温度为50 ℃、提取时间为60 min等条件,分别展开NaOH浓度(0.20、0.25、0.30、0.35、0.40 mol/L)、料液比(1∶8、1∶9、1∶10、1∶11、1∶12 g/mL)、提取时间(40、50、60、70、80 min)、提取温度(40、45、50、55、60 ℃)4个单因素,在单因素的基础上,设计L9(34)正交试验,正交表设计见表1。以碱溶性蛋白提取率为单因素及正交试验的评价指标。根据公式(2)计算出碱溶性蛋白质的提取率。

式(2)

碱溶性蛋白提取率(%)=碱溶性蛋白质量/原料中蛋白质质量×100

1.3 碱溶性蛋白的性质测定

1.3.1 功能性质的测定 溶解性的测定参照刘诗长[22]的方法;吸水性、吸油性的测定参照李雪琴等[23]的方法;乳化性的测定参照张佳兰[24]的方法;起泡性及起泡稳定性的测定参照王振斌等[25]的方法。

1.3.2 碱溶性蛋白的氨基酸组成分析 参照何云[26]、陈二生等[27]的方法,准确称取0.500 g碱溶性蛋白冻干粉放置于水解管中,加10 mL的 6 mol/L HCl,充入氮气,封住水解管瓶口,于110 ℃干燥22 h后,取出冷却至室温,将水解液转移并用蒸馏水定容至50 mL容量瓶后,取1 mL溶液减压浓缩后,加1 mL缓冲液混匀后,用0.22 μL滤膜过滤得滤液后,用氨基酸自动分析仪测量17种氨基酸(色氨酸除外)组成。

1.3.3 碱溶性蛋白的SDS-PAGE实验 采用mini PROTEAN电泳槽进行聚丙烯酰胺凝胶电泳[28-29]。取适当浓度的碱溶性蛋白样品溶液与2×电泳上样缓冲液按1∶1体积比例混合,于沸水中水浴10 min,8000 r/min离心10 min,上样量为10 μL,在100 V的电压下进行电泳90 min,电泳结束后,用考马斯亮蓝R-250染液进行染色90 min后,用脱色液脱去胶片蓝色背景色后,将脱色液换成蒸馏水,电泳结果采用电泳成像系统拍照。

1.4 数据处理

采用Excel软件进行数据分析和作图,单因素及正交试验的每个处理重复3次,实验数据以平均值±标准差表示,采用SPSS 17.0对数据进行方差分析,显著水平为P<0.05。

2 结果与分析

2.1 金鲳鱼加工副产物基本成分分析

金鲳鱼加工副产物的基本组成成分测定结果见表2。

表2 金鲳鱼加工副产物的基本组成成分(%)

表2显示,金鲳鱼加工副产物(干重)粗蛋白含量占28.42%±0.48%,高于罗非鱼下脚料的蛋白质含量[30];戴梓茹等[31]测定金鲳鱼肌肉的粗蛋白含量为19.65%±0.45%,本研究测定结果与其有一定区别,可能是取材部位不同而导致,本研究所测副产物的粗蛋白含量较高,显示出金鲳鱼加工副产物具有较高的回收利用价值。

2.2 碱溶性蛋白等电点的测定

采用碱提酸沉法提取金鲳鱼加工副产物干粉中的碱溶性蛋白,酸沉pH调节在2.6～5.6范围内,测定碱溶性蛋白质的沉淀率,沉淀率达到最高时的pH即为等电点(pI),测定结果见图1。

图1 酸沉pH对金鲳鱼加工副产物碱溶性蛋白沉淀率的影响

当pH接近等电点时,蛋白结构重新折叠,表面净电荷几乎为零,水合作用弱,蛋白质容易发生聚集沉淀[32]。图1显示,当pH在2.6～5.6范围内,随着pH增大,沉淀率先降低后上升有下降,pH为4.6时,达到最大峰值88.3%,因而确定碱溶性蛋白最佳酸沉pH为4.6,即pI为4.6。后续的单因素及正交试验酸沉pH固定为4.6。

2.3 单因素实验结果

2.3.1 NaOH浓度对金鲳鱼加工副产物中碱溶性蛋白提取率的影响 固定料液比为1∶10 g/mL、提取温度为50 ℃、提取时间为60 min等的提取条件,测定不同NaOH浓度对碱溶性蛋白提取率的影响,结果见图2。

图2 NaOH浓度对金鲳鱼加工副产物中碱溶性蛋白提取率的影响

由图2可知,在NaOH浓度为0.20～0.30 mol/L时,随着浓度的增大,碱溶性蛋白的提取率呈现上升趋势,在NaOH浓度达到0.30 mol/L时,碱溶性蛋白提取率达到最高72.95%,之后提取率降低,因此最佳NaOH的提取浓度为0.30 mol/L。

2.3.2 料液比对金鲳鱼加工副产物中碱溶性蛋白提取率的影响 固定NaOH浓度为0.30 mol/L、提取温度为50 ℃、提取时间为60 min等提取条件,测定不同的料液比对碱溶性蛋白提取率的影响,结果见图3。

图3 料液比对金鲳鱼加工副产物中碱溶性蛋白提取率的影响

由图3可知,蛋白质提取率在料液比为1∶9 g/mL时,达到最高73.47%;当料液比继续增大时,碱溶性蛋白的提取率反而略微降低并趋于平缓,可能是因为蛋白质分子表面形成水化膜,从而使蛋白质的溶解度随提取液溶液体积增大到一定程度后不再增大[33],从而使得蛋白质提取率下降。因而选取最适料液比为1∶9 g/mL。

2.3.3 提取时间对金鲳鱼加工副产物中碱溶性蛋白提取率的影响 固定NaOH浓度为0.3 mol/L、料液比为1∶9 g/mL、提取温度为50 ℃的提取条件,测定不同的提取时间对碱溶性蛋白提取率的影响,结果见图4。

图4 提取时间对金鲳鱼加工副产物中碱溶性蛋白提取率的影响

图4显示,当提取时间达到70 min时,碱溶性蛋白的提取率最高74.56%,即溶出的蛋白质最多,随着提取时间继续增大,蛋白质的提取率趋于平缓并略有下降,表明随着溶解时间的延长,蛋白质的水解程度越大[34],从而导致的蛋白质的提取率有所下降。因而选取提取碱溶性蛋白的最适提取时间为70 min。

2.3.4 提取温度对金鲳鱼加工副产物中碱溶性蛋白提取率的影响 固定NaOH浓度为0.3 mol/L、料液比为1∶9 g/mL、提取时间为70 min等提取条件,测定不同提取温度对碱溶性蛋白提取率的影响,结果见图5。

图5 提取温度对金鲳鱼加工副产物中碱溶性蛋白提取率的影响

图5显示,随着提取温度的提升,碱溶性蛋白的提取率也不断提高,当提取温度达到55 ℃时,碱溶性蛋白的提取率达到了最高75.97%;提取温度继续增大,蛋白质的提取率反而降低,原因是当提取温度继续增大时,过高的温度会破坏和影响碱溶性蛋白质的结构及性质,从而使碱溶性蛋白提取率降低[26]。因而选取提取碱溶性蛋白的最适提取温度为55 ℃。

2.4 正交试验结果

按照正交试验因素水平表1进行正交试验,测定碱溶性蛋白的提取率,并进行数据处理,结果见表3。

表3中极差分析可知,影响金鲳鱼加工副产物中碱溶性蛋白的提取的主次因素为C(提取温度)>A(NaOH浓度)>D(提取时间)>B(料液比),最佳因素水平的组合为A2B1C1D2,即NaOH浓度为0.3 mol/L、料液比为1∶8 g/mL、提取温度为50 ℃、提取时间为70 min。验证实验可知,该条件下碱溶性蛋白的提取率达到最大为83.71%,与陈二生等[28]用酸碱法提取鲢鱼下脚料蛋白质的提取率(89.21%)接近,显示出碱提法回收提取水产品加工副产物蛋白的良好应用前景;而刘慧清等[13]采用热水浸提法和碱提法提取罗非鱼鱼头蛋白的提取率分别为76.02%和89.97%,比较而言,碱提法的提取效率稍高,而热水浸提法提取率较低,是因为热水浸提法引起大分子蛋白质部分降解[13],从而导致提取率较低,说明碱提法相比热水浸提法具有较高的提取率。

表3 碱溶性蛋白提取的正交试验结果分析表

2.5 碱溶性蛋白的功能性质测定结果

2.5.1 碱溶性蛋白的溶解度测定 调节pH在4～11范围内,测定碱溶性蛋白质的溶解度,结果见图6。

图6 不同pH对碱溶性蛋白溶解度的影响

图6显示,当pH在4.0～7.0范围内,随着pH增大,溶解度随之增大,pH为9.0时,溶解度达到最大93.33%。

2.5.2 吸油性、吸水性、乳化性、起泡性、起泡稳定性的测定 结果碱溶性蛋白的吸油性为(5.5±0.4) mL/g,吸水性为(1.85±0.15) mL/g,略高于鮰鱼分离蛋白的测定结果[24];乳化性为43.44%±2.27%,略低于罗非鱼下脚料分离蛋白,具有较好的乳化性[22];起泡性和起泡稳定性分别为75.33%±5%和37.5%±3.5%,与鸢乌贼分离蛋白[28]起泡性结果相似,但起泡稳定性较差。

2.5.3 氨基酸组成分析 碱溶性蛋白质样品水解后,氨基酸分析测定结果见表4。

表4 碱溶性蛋白的氨基酸组成(g/100 g蛋白质)

表4是金鲳鱼加工副产物中碱溶性蛋白的17种氨基酸组成,其中色氨酸未测。必需氨基酸(除色氨酸外)35.99 g/100 g蛋白质,约占碱溶性蛋白氨基酸的47.84%。必需氨基酸占非必需氨基酸量为91.72%,其中丙氨酸的含量最高,达14.023 g/100 g蛋白质,其次是赖氨酸(11.633 g/100 g蛋白质)、甘氨酸(9.759 g/100 g蛋白质)、亮氨酸(8.474 g/100 g蛋白质)、苯丙氨酸(4.693 g/100 g蛋白质)等,七种必需氨基酸含量均比较高。组成金鲳鱼加工副产物中碱溶性蛋白的氨基酸(色氨酸除外)总量为75.23 g/100 g蛋白质,比金鲳鱼鲜样(20.62 g/100 g蛋白质)高[31],低于秋刀鱼(93.68 g/100 g蛋白质)[35],是较优质的蛋白质。

甘氨酸、天冬氨酸、丙氨酸和谷氨酸能呈现食物特殊鲜味,统称为鲜味氨基酸[36-37]。谷氨酸、天门冬氨酸呈鲜味,而甘氨酸和丙氨酸则呈甘味[38]。由表4可以看出,碱溶性蛋白鲜味氨基酸含量为(25.751 g/100 g蛋白质),占氨基酸总量的34.23%,含量略低于必需氨基酸含量,这说明金鲳鱼加工副产物提取中碱溶性蛋白是一种味道较鲜美的蛋白质。

2.5.4 SDS-PAGE凝胶电泳 对金鲳鱼鱼糜、碱溶性蛋白进行SDS-PAGE电泳，结果见图7。

图7 碱溶性蛋白的SDS-PAGE电泳图

图7显示,金鲳鱼鱼糜的蛋白质分子量很密集,在44.3～245 kDa之间存在很多分子量,其次在17～48 kDa之间也存在六条条带,说明金鲳鱼鱼糜蛋白质分子量跨度大[26]。同鱼糜比较,碱溶性蛋白主要有四条条带,主要分布在44.3～100 kDa之间,其中90 kDa是副肌球蛋白[38],44.3 kDa是肌动蛋白[9],其中肌动蛋白属于肌原纤维蛋白的组成之一[39]。

3 结论

碱提法从金鲳鱼加工副产物中提取碱溶性蛋白的最佳工艺条件为碱提浓度0.3 mol/L、料液比1∶8 g/mL、碱提温度50 ℃、碱提时间70 min,碱溶性蛋白提取率达到83.71%;碱溶性蛋白具有较好的吸油性、吸水性、乳化性和起泡性,pI为4.6,pH为9.0时溶解度最大;其必需氨基酸(除色氨酸外)和鲜味氨基酸含量均较高;含有与鱼糜蛋白相同的主要组成成分副肌球蛋白和肌动蛋白,是一种较优质蛋白。利用废弃副产物回收碱溶性蛋白,可以保护环境及提高金鲳鱼的产业附加值,也可以为金鲳鱼加工副产物深加工提供理论参考。