利用Illumina高通量测序技术筛选低温降解玉米秸秆真菌

徐丽萍,姜 喆,葛英亮,王 鑫,倪 燕

(1.哈尔滨商业大学食品工程学院,黑龙江哈尔滨 150076;2.海南热带海洋学院食品科学与工程学院,海南三亚572022;3.东北农业大学食品学院,黑龙江哈尔滨 150030;4.黑龙江省绿色食品科学研究院,黑龙江哈尔滨 150028;5.国家大豆工程技术研究中心,黑龙江哈尔滨 150028)

纤维素物质是人类所需的最丰富的可持续利用资源,是植物界最丰富的天然高分子化合物和土壤中主要的有机碳组分[1-2]。自Pringsheim等1912年首次从土壤中分离出纤维素分解菌以来,人们相继开展了对农作物秸秆纤维素降解方面的研究,而我国北方每年都产生大量玉米秸秆且因气温较低导致纤维素降解受到抑制[3]。

自然条件下,秸秆内纤维素的降解是一个复杂过程,需要微生物产生的多种纤维素酶参与[4]。自然界中也存在着各类真菌、细菌和放线菌等纤维素降解菌,其中,细菌所产生的纤维素酶酶系单一、酶的分离提取也比较困难;筛选放线菌难度较大、产量较低,所以研究较少[5]。而真菌因其具有较高的胞外酶活和胞内酶活且酶种类比较全面,使其具有很强的纤维素降解能力,成为降解纤维素的主要菌类之一[6-8]。目前,对于纤维素降解真菌的研究主要集中在中温菌及常温菌,对于低温降解真菌的研究较少,低温条件进行筛选具有高效、环保、成本低等优点[9-11]。且根际是植物、土壤、微生物之间进行物质和能量交换的关键区域,所以对玉米秸秆及根部土壤真菌菌群的研究及低温降解菌的筛选,可为解决中温带及寒温带产区过剩秸秆因冬季气温较低且持续时间长难以降解利用提供帮助[12-14]。

高通量测序方法相较于传统的纯培养技术更能深入挖掘微生物群落的结构,从而为分析微生物的降解代谢提供理论依据。在本实验研究中,采用高通量测序方法对玉米秸秆及秸秆根部土壤上附着的真菌群落进行分析,并在低温下以羧甲基纤维素钠(CMC-Na)为唯一碳源,对玉米秸秆表面和根际土壤中可耐低温、且可以大量生产的纤维素酶的真菌进行分离、纯化,在不同温度下测定平板水解圈大小,结合液态发酵测其失重率进行复筛,将理想菌株进行鉴定,以期筛选出简单、高效且耐低温的秸秆降解菌,对解决中温带及寒温带地区过剩的玉米秸秆降解有积极意义。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

玉米秸秆根部附着土壤及玉米根部秸秆 采集于秋季中国北部黑龙江省绥化地区的田间,标记为A、B,-20 ℃低温保存。该地区年平均温度为2.8 ℃左右,地处中温带,每年3～5月与8～10月即农耕前与秋收后气温的平均气温均处于0～15 ℃,因此,筛选真菌降解菌的温度选为15 ℃;FastDNA Spin Kit For Soil 北京智杰方远科技有限公司;Biospin Fungus Genomic DNA 北京博迈斯生物科技有限公司;QuickClean II PCR抽提试剂盒 南京金斯瑞生物科技有限公司;TransStart FastPfu DNA Polymerase 北京全式金微生物技术有限公司;TruSeqTMDNA Sample Prep Kit 美国Illumina公司。

SW-CJ-2FD超净工作台 上海博迅实业有限公司医疗设备厂;Scan300全自动菌落计数仪 法国Interscience公司;DSX-280B手提式压力蒸汽灭菌锅 上海申安医疗器械厂;HS-IE数显振荡培养箱 上海和盛仪器科技有限公司;JJ224BC分析天平 常熟市双杰测试仪器厂;GeneAmp9700 PCR仪 美国应用生物系统(ABI)公司;DYCZ-24K/S型双板垂直电泳仪 北京六一生物科技有限公司;Miseq PE300二代高通量测序仪 美国Illumina公司。

1.2 实验方法

1.2.1 基因组DNA提取及ITS测序 按照试剂盒说明,分别提取样品中基因组DNA,利用通用引物ITS1(5′-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3′)-ITS2(5′-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3′)对提取的基因组DNA进行PCR扩增。扩增条件为:95 ℃反应5 min;95 ℃、40 s,58 ℃、40 s,72 ℃、60 s循环30次;72 ℃延伸5 min,4 ℃终止反应[15]。扩增完成后,用2%琼脂糖凝胶电泳检测各样品扩增产物,并委托上海美吉生物医药科技有限公司MiSeq建库及生物多样性测序,最后对样品进行α-多样性分析、真菌群落组成分析和样本差异显著性分析[16]。

1.2.2 玉米秸秆低温降解菌初筛 称取A、B样品各0.5 g,放入研钵中,少量无菌盐水研磨后转入装有49.5 mL无菌生理盐水的三角瓶中,15 ℃、120 r/min,振荡30 min[17]。振荡结束后静置30 min,吸取9 mL上清液移至装有90 mL富集培养基中,15 ℃富集3 d[18]。采用稀释梯度法制备10-1、10-3、10-5、10-7、10-9浓度稀释液,分别涂布于马铃薯葡萄糖培养基,15 ℃倒置培养,挑取菌落划线纯化至纤维素平板培养基,反复纯化,直到得到单菌落[19]。

1.2.3 玉米秸秆低温降解菌复筛 将纯化后的菌株点接在鉴别培养基上[20]。分别在0、5、10、15 ℃倒置培养10 d,培养结束后用1 mg/mL刚果红染色1 h,1 mol/L的NaCl脱色1 h,观察并用Scan 300菌落计数仪拍照记录透明圈的大小,测定透明圈与菌落直径的比值,以此为依据初步衡量降解纤维素能力的大小[21]。

1.2.4 液态发酵降解实验 将纯化后的菌株转移至马铃薯葡萄糖培养基中,15 ℃培养3 d后按5%接种量转移至液态发酵培养基,15 ℃、120 r/min振荡培养[22]。15 d后将秸秆降解剩余物在1 mm过滤网内用大量清水冲洗,除去附着菌体和可溶性物质,在105 ℃条件下烘干至恒重,同时称取秸秆剩余物干重[23]。计算秸秆相对降解率:

式中:R表示降解率,%;m0表示降解前秸秆干重,g;m1表示降解后秸秆干重,g。

1.2.5 菌种鉴定 将筛选得到的菌株点接至培养基,15 ℃恒温培养5 d后观察菌落形态,包括菌株的形状、颜色、菌丝状态等主要形态学特征[24]。真菌ITS区基因分析中引物合成及测序均由上海美吉生物医药科技有限公司完成,将测序结果拼接,登陆NCBI网站(http://www. ncbi. nlm.nih. gov),获得相似序列的物种信息,判断菌属。

1.3 数据处理

数据处理采用R语言和mothur(https://mothur.org/wiki/Main_Page)软件进行分析作图,通过对比Unite(Release 7.0 http://unite.ut.ee/index.php)真菌数据库统计样本的群落组成。

2 结果与分析

2.1 多样性测序数据分析

2.1.1 多样性测序结果 对玉米秸秆及根部土壤真菌群落进行测序,共获得20715913个碱基(base,bp),被聚类为251个OTU,共拼接成82250个基因片段,平均长度为249.29 bp。

2.1.2α-多样性分析 对测序结果进行α-多样性分析以确定样本内真菌群落的丰度及多样性情况,见表1。

表1 样本Alpha多样性指数表

由表1可见,秸秆根部土壤的Sobs、Ace、和Chao指数高于玉米秸秆,说明秸秆根部土壤中的真菌群落丰富度较高;两样本的Shannon、Simpson指数较相近,即二者之间真菌群落结构相似,需要进一步对比分析;Coverage值均较高,表明样本中序列被测出的概率高、群落覆盖度广,满足后续真菌多样性的分析[25]。

在相似水平97%上进行OTU聚类分析(Operational Taxonomic Units),利用mothur软件进行分析并绘制Shannon曲线。Shannon指数随着测序深度增加而趋于平坦,说明测序数据量足够大,可以反映样本中绝大多数的微生物多样性信息,覆盖范围广。从图1可以看出,A样本真菌群落水平多样性高于B样本,原因可能是:秸秆根部土壤存在着大量的微生物群落,与玉米秸秆根部存在着微生物的直接接触,二者之间可能存在菌群交换,拥有共同的微生物菌群,彼此有很大机会成为各自的内生菌群,且土壤环境是植物微生物群的主要来源,所以微生物多样性较玉米秸秆丰富,有待进一步研究[26]。

图1 样本真菌群落Shannon曲线

2.1.3 真菌群落Heatmap图分析 根据样本间丰度的相似性在属水平上进行聚类,对样本中丰度前30的真菌进行分析,获得可以分类的真菌群落Heatmap图,通过灰度变化与相似程度来反映不同秸秆群落微生物在属水平上群落组成的相似性和差异性。

如图2所示,Heatmap图清晰的显示了样本中真菌群落的多样性和丰度。结果表明,A样本与B样本优势属不同,A样本中已知可分类的丰度较高的真菌菌属依次为Guehomyces、Mortierella、Fusarium、Exophiala、Humicola、Cryptococcus、Cyphellophora、Monographella等;B样本中已知可分类的丰度较高的真菌菌属依次为Guehomyces、Leptosphaeria、Cystofilobasidium、Tetracladium等。样本中共有的已知可分类的优势菌属为Guehomyces,丰度较高、活性较大,可能具有分泌纤维素酶的能力。

图2 样本真菌群落属水平Heatmap图

2.1.4 样本差异显著性分析 根据测序得到的真菌群落丰度数据,运用卡方检验(Chi-aquare test)、费舍尔检验(Fisher’ exact test),在门水平上对秸秆及根部真菌群落进行显著性差异检验,评估样本丰度差异的显著性水平,通过比较得知样本间的差异物种,如图3所示。

图3 样本真菌门水平差异显著性分析

从图中可以看出,测序结果在门水平上可分为五类,分别为Basidiomycota(担子菌门)、Ascomycota(子囊菌门)、Zygomycota(接合菌门)、unclassified_k_Fungi(未分类真菌)和Chytridiomycota(壶菌门)。左侧柱形图的长度表示该菌门在各样本中的相对丰度,右侧图表示在95%置信区间上样本间的比例差异,可以看出,A样品与B样品中Basidiomycota、Ascomycota、Zygomycota、unclassified_k_Fungi存在极显著差异,Chytridiomycota无显著性差异。

2.2 玉米秸秆低温降解菌的筛选

从玉米秸秆及秸秆根部土壤中共分离出13株既能在以CMC-Na为唯一碳源的培养基上生长，且能产生明显的透明圈的真菌菌株,说明这13株真菌具有分解纤维素的能力,由于菌株的降解能力与透明圈大小成正比,因此筛选出3株产酶能力较强的纤维素降解真菌，分别为FB1、FB7、FB8，通过比较0、5、10、15 ℃低温下经刚果红染色产生的透明圈与菌落直径的比值，结合液态发酵测定3株真菌的降解率分别是27.66%、21.53%、23.01%；在0、5、10、15 ℃对透明圈最大的菌株(FB1)进行降解实验，测得其水解产生透明圈直径(cm)与菌落直径比值(cm)分别为2.36、2.32、2.13、2.01,因此确定菌株FB1降解效果最佳,并对其进行菌属鉴定。

图4 菌株FB1不同温度透明圈

2.3 玉米秸秆低温降解菌的鉴定

2.3.1 形态学观察 如图5所示,菌株FB1在培养基上的菌落整体呈深绿色、圆形,与培养基结合紧密,菌落中心凸起,由内向外由颜色不同呈现3个同心圆环,向外依次为黄褐色、灰绿色、黄白色绒毛状,边缘整齐。

图5 菌株FB1形态

2.3.2 分子生物学鉴定 菌株FB1培养至对数期,提取DNA后使用通用引物ITS1和ITS4引物序列进行扩增,PCR扩增采用20 μL体系,95 ℃、5 min;95 ℃、30 s,56 ℃、30 s,72 ℃、90 s,25个循环;72 ℃、10 min。用1%琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物,DNA片段清晰明亮无杂带,大小在500 bp左右,如图6。目的片段回收后送至美吉生物医药科技有限公司测序,测序结果与NCBI数据库进行比对,结合FB1菌落形态特征及基因序列分析,确定该菌株属于假枝孢霉(Cladosporiumpseudocladosporioides)[27]。

图6 ITS序列PCR产物电泳结果

3 结论

本研究对玉米秸秆及秸秆根部土壤中真菌群落进行多样性测序,α-多样性分析、Heatmap图分析及样本差异显著性分析发现,玉米秸秆及秸秆根部土壤真菌多样性丰富,通过分离筛选确定菌株FB1降解效果最佳,培养温度在0、5、10、15 ℃时透明圈与菌落直径的比值分别为2.36、2.32、2.13、2.01,发酵15 d的降解率为27.66%,通过ITS测序得知FB1为假枝孢霉。综上,通过高通量测序能够预测可能分泌纤维素酶的真菌菌株,同时低温筛选真菌降解菌可为低温玉米产区解决秸秆过剩问题提供帮助。