白芷质量分析及标准探索研究

李珍 孟美英 杨洋 张烨 吕彩莲 丁华（鄂尔多斯市药品医疗器械检验研究中心鄂尔多斯017000）

白芷为伞形科植物白芷或杭白芷的干燥根,最早收载于《神农本草经》，临床主要用于治疗感冒头痛、鼻塞、鼻渊、白带等证，常用于多种中成药组方[1]，也作为药食同源药材被百姓广泛接受并普遍使用。白芷药材主要含香豆素类化合物，现行标准《中国药典》2015年版一部“白芷”项下的检验方法专属性较强，基本可以控制市场上白芷的质量，但薄层鉴别和含量测定方法仍可提高完善。由于欧前胡素和异欧前胡素均为白芷的主要化学成分，但目前药典“白芷”项下的含量测定指标为欧前胡素，国内文献资料[2-7]对白芷中欧前胡素和异欧前胡素虽然有研究检测，但多数沿用甲醇和水为流动相且都缺少耐用性试验。本文在参考结合上述文献基础上，经过对多批次白芷的质量分析研究，建立了欧前胡素含量快筛方法。在此基础上，又增加了白芷另一指标性成分异欧前胡素的含量测定方法，且采用HPLC法实现对白芷中欧前胡素和异欧前胡素两种化学成分同时进行测定，实验结果显示两种成分达到了较好的分离效果，方法简便，重复性好。此次检验研究既对现行药典白芷含量测定方法进行了改进，又有效控制了市场上白芷药材的质量。

1 质量分析

本次抽取的49批白芷覆盖了内蒙古自治区12个盟市的51家医疗机构和经营单位，由河北、内蒙古、黑龙江等7个省的36家企业生产。全项检验结果合格率为93.9%，所有批次性状、鉴别、水分、浸出物项符合药典要求，主要不合格项目集中在含量测定与总灰分检验。结果发现其理化鉴别与含量对应，彼此验证，呈现正关联。另外除水分、总灰分检查项外，其余项目结果与外观性状并非理想的正态分布。这可能与药材（饮片）的产地、来源、采收期、炮制工艺、贮存养护以及票据与样品的匹配程度有一定的关系。

样品中49%的白芷来源于河北省企业，同一生产企业生产不同批次的该药品、同一企业生产的同一批次样品在不同销售地域之间、同一个企业生产的饮片在市、县、乡级各医疗单位与经营单位之间都存在质量差别。

整体来看，市场上白芷栽培品种日益增多，从性状上观察有明显变化，断面颜色出现黄棕色。检查项下水分、总灰分测得数据分布相对集中，总灰分有1批超出限度。浸出物结果数据较分散，从略高于标准的15.5%至高于标准4.8倍的73.3%，数值跨度很大。含量测定总体趋势与浸出物相似,数据分布于0.050%～0.314%，2批次低于标准值，最高值为标准值的3.7倍，且与浸出物值非正相关。二氧化硫残留量的测定结果为14批样品有不同程度的二氧化硫残留，最高值为50 mg·kg-1，但均符合药典要求。

数据统计及综合分析结果发现：性状颜色与欧前胡素含量高低有关，横切面颜色呈黄棕色明显高于呈白色的白芷样品；浸出物与含量不存在明显的关联；二氧化硫残留量结果与样品含量有关，研究发现经二氧化硫熏蒸后样品欧前胡素含量会降低，这与文献[8]结论一致。

2 探索发现

大量的试验表明白芷欧前胡素含量测定项下：在白芷样品主峰欧前胡素保留时间前10～20 min出现的肩峰与白芷药材（饮片）品种及质量等其他因素有关，此峰的高低、大小不同，白芷药材（饮片）的外观性状、欧前胡素含量均有所差别。实验发现只需通过所得白芷样品液相图谱大致出峰时间及峰形，无需计算即可判断欧前胡素的含量范围。含量值大于等于0.138%时，色谱图中必然在主峰欧前胡素保留时间前10～20 min之间出现前低后高的肩峰且响应值高；当含量值小于0.110%时，色谱图中不出现前低后高的肩峰；而含量在0.110%～0.138%之间则偶尔会出现该峰，即只要主峰欧前胡素保留时间前10～20 min之间出现前低后高的肩峰，含量测定项就符合现行药典规定标准。这样借助液相色谱图初判白芷含量大致范围的方法，不但能检查控制白芷的内在质量，还可实现部分企业方便快捷、节约成本、耗时少见效快的检验目的，故认为可用于白芷含量的快速初筛。色谱图见图1，验证数据见表1。具体方法如下：

色谱条件与系统适应性试验：以十八烷基键合硅胶为填充剂；流动相为甲醇-水（45∶55）、乙腈-水（48∶52）、乙腈-0.1%的磷酸水溶液（48∶52）中的任一种，且流动相比例可上下浮动5%；检测波长为300±2 nm、249±2 nm中的任一种，分离度不低于1.5，理论塔板数按欧前胡素峰计算，应不低于5000。

对照品溶液的制备：取欧前胡素对照品或含欧前胡素对照品的混合对照适量，加甲醇或乙醇配制成一定浓度的对照品溶液，浓度为 1.2～19.3 μg·min-1时最佳。

样品溶液的制备：称取一定量的白芷样品，取样量为0.1～5.0 g最佳，加一定量甲醇或不同浓度的乙醇超声或回流提取，提取溶剂用量以5～100 mL，时间为30～60 min时最佳。取出，放冷，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

分别精密吸取对照溶液与供试品溶液各5～20 μL，注入液相色谱仪，测定，观察色谱图。

表1 快筛结果规律验证表Tab1 The verification table of rapid screening

3 含量测定研究

3.1 仪器与试剂试药：AL204-IC型电子天平（北京赛多利斯天平有限公司）；PB211D型电子天平（北京赛多利斯天平有限公司）；KQ-5200DE型超声清洗仪（昆山市超声仪器有限公司）；U3000型高效液相色谱仪，包括紫外检测器（赛默飞世尔科技有限公司）；1260型高效液相色谱仪，包括二极管阵列检测器（美国Agilent公司）。欧前胡素对照品（中国食品药品检定研究院，批号：110826-201618，纯度99.6%）和异欧前胡素对照品（中国食品药品检定研究院，批号：110827-201611，纯度99.4%）。乙腈为色谱纯，其他均为分析纯试剂，水为离子交换高纯水。

3.2 方法学验证

3.2.1 对照品溶液的制备：精密称取欧前胡素和异欧前胡素对照品适量，置量瓶中，加甲醇制成每1 mL含10 μg的溶液，即得。

3.2.2 供试品溶液的制备：取本品粉末（过3号筛）约0.4 g，精密称定，置容量瓶中，加入甲醇约45 mL，密塞，超声50 min，取出，放冷，加甲醇至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

3.2.3 色谱条件的选择与系统适应性试验：色谱柱：十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，Tnature（250 mm×4.6 mm，5 μm）柱和 WondaCract ODS-2（250 mm×4.6 mm，5 μm）柱；乙腈-水（48∶52）为流动相，检测波长249 nm，柱温30℃，进样量20 μL，分离度不得低于1.5，理论塔板数按欧前胡素峰计，不得低于5000。

3.2.4 线性关系考察：分别精密吸取 1.25、2.5、5、10、15、20 mL 欧前胡素贮备液（浓度为 96.5124 μg·mL-1）置 100 mL 容量瓶中，加甲醇使溶解，并稀释至刻度，摇匀。分别精密吸取1.25、2.5、5、10、15、20 mL 异欧前胡素贮备液（浓度为 93.3366 μg·mL-1），置 50 mL容量瓶中，加甲醇使溶解，并稀释至刻度，摇匀。精密吸取上述溶液各20 μL分别注入液相色谱仪，按“3.2.3”项下条件测定,以峰面积对进样量进行回归分析。结果欧前胡素、异欧前胡素分别在24.2～386 ng，46.66～746.6 ng范围内呈良好的线性关系。回归方程为：欧前胡素Y=1.1092X+0.0986,r=1.0000；异欧前胡素Y=0.9281X+0.2390,r=0.9998。

3.2.5 精密度与重复性试验：取“3.2.1”项下对照品溶液，连续进样5次，欧前胡素和异欧前胡素峰面积的RSD分别为0.14%和0.30%（n=5），证明精密度良好。

取供试品（1号样）6份，各约 0.4 g，精密称定，按“3.2.3”项下条件测定，欧前胡素与异欧前胡素含量值RSD依次为0.43%和0.83%（n=6），表明样品的重复性良好。

3.2.6 稳定性试验：取同一供试品溶液（1号样），分别于0 h、5 h、10 h、18 h、24 h进行测定，欧前胡素与异欧前胡素峰面积的RSD依次为0.89%和0.64%（n=5），表明样品在24 h内稳定。

3.2.7 准确度试验：取供试品9份，每份约0.20 g（1号样，含欧前胡素 2.422 mg·g-1异欧前胡素 0.940 mg·g-1），精密称定，置容量瓶中。各依次精密加入低、中、高质量浓度的欧前胡素对照品溶液，加入低、中、高质量浓度的异欧前胡素对照品溶液，按“3.2.2”项下方法制备供试品溶液，再按“3.2.3”项下色谱条件进行测定，记录峰面积并计算加样回收率，结果见表2、表3。

表2 欧前胡素加样回收试验结果（n=9）Tab2 Results of Imperatiorin recovery tests（n=9）

表3 异欧前胡素范围与准确度考察结果表（n=9）Tab3 Results of Isoimperatorin recovery tests（n=9）

3.2.8 峰一致性及纯度试验：对比二极管阵列检测器全波长扫描测定结果，发现供试品与对照品的保留时间一致，相应的紫外全扫描图也一致，且均为单一成分。

3.2.9 耐用性试验：换不同厂家、不同型号的色谱柱和高效液相色谱仪（色谱柱依次为 Tnature C18、WondaCract C18、WondaCract C18，液相色谱仪依次为赛默飞U3000、安捷伦1260、Waters2695），按确定的色谱条件，取重复实验中的1号样品进行测定。三台仪器所测主峰的峰形良好，并且主峰与其他峰的分离度远大于1.5，测得的欧前胡素的RSD为2.48%，异欧前胡素的RSD为2.44%，表明耐受性良好。

3.2.10 结果对比：对49批白芷样品进行了双成分测定，与药典方法测定结果对比，结果表明两种方法所测结果基本相同，进一步证明此次探索的新方法可行性高。

4 讨论

4.1 质量标准亟待完善方面：第一，现行药典薄层鉴别项下所用展开剂均为低沸点试剂，展开过程中容易造成试剂减少以及展开剂比例的变化，使得展距和成分分离效果不佳。针对上述情况我们进行了改进，将展开槽放入4℃冰箱的冷藏柜体，效果良好。故建议药典添加恒温低温环境展开字样。第二，含量项下流动相中，甲醇和水的组合容易导致高效液相柱压过高，使保留时间偏移或色谱柱塌陷，为了减少接近等比例的甲醇和水流动相造成的高柱压而选用乙腈-水（48∶52）为流动相。第三，二氧化硫熏蒸、药材性状颜色变化等均对含量数值有影响，应加强种植企业生态环境管理以及生产企业炮制工艺储存方面的监管。

4.2 现行标准探索发现问题：经过大量试验验证：欧前胡素保留时间前10～20 min出现的肩峰的高低和大小均与白芷药材（饮片）品种及质量有关，只要主峰欧前胡素保留时间前10～20 min出现的前低后高的肩峰，含量项就符合现行药典的规定。凭借一张色谱图即可判断大致的含量范围，方法方便快捷，节省人力物力同时还大大缩短了检验周期，故认为可用于白芷质量的快速初筛。

4.3 含量测定研究中提取溶剂、方法、时间及流动相的选择：参考文献[6]，结合香豆素类物质的溶解性能，选用了乙酸乙酯、乙醚、甲醇、35%乙醇、70%乙醇以及95%乙醇为溶剂，超声提取发现70%的乙醇和甲醇对异欧前胡素的提取效率相当，但甲醇对欧前胡素的提取明显高于70%的乙醇，故确定甲醇为提取溶剂。分别采用超声、回流提取方式和不同提取时间20 min、30 min、40 min、50 min、60 min、80 min做正交试验考察,结果显示两种方式的提取效率几近相同，提取时间为50 min的提取效率最高，因此选择超声处理50 min，乙腈-水为流动相洗脱测定欧前胡素和异欧前胡素含量，实验结果显示该实验条件下各成分峰可达到有效分离且峰形均良好，经方法学验证各项数值均满足要求，表明新建质量标准方法可行。