一种滴滴涕胶体金免疫快速检测试纸条的研制
2020-10-23万宇平何方洋贾芳芳崔娜崔海峰北京勤邦生物技术有限公司北京市食品安全免疫快速检测工程技术研究中心
□ 万宇平 何方洋 贾芳芳 崔娜 崔海峰 北京勤邦生物技术有限公司 北京市食品安全免疫快速检测工程技术研究中心
□ 郑百芹(通信作者) 唐山市食品药品综合检验检测中心
引言
滴滴涕(dichlorodiphenyltrichloroethane,简称“DDT”)是一种高毒有机磷杀虫剂,其应用广泛,因对害虫有触杀、胃毒等作用而被用于防治蚊蝇和臭虫[1-3]。由于该药物化学性质较为稳定,容易富集污染环境,并可通过食物链进入人体而危害健康。因此,早在2009年,我国就已全面禁止了滴滴涕的生产、使用和进出口。但时至今日,仍有部分养殖户使用滴滴涕作为杀虫剂,故对该农药残留进行检测具有必要性[4-6]。
目前,检测滴滴涕的方法大多为仪器方法[7-14],但此类方法成本较高、检测时间长、操作复杂,不符合基层实验室高效、便捷的检测要求。因此,本研究制备出一种滴滴涕的单克隆抗体,将其应用于胶体金免疫快速检测试纸条,可实现高效、便捷的检测。
1 材料和方法
1.1 材料与仪器
滴滴涕、五氯硝基苯、百菌清和溴氰菊酯等标准品(纯度≥95%),购自北京标准物质研究中心;柠檬酸三钠、碳酸钾,购自北京百欣试剂公司;样本提取剂、样本复溶液、胶体金分析仪,由北京勤邦生物技术有限公司提供;涡旋仪、均质器,购自湖南湘立科学仪器有限公司[15-16]。
图1 滴滴涕半抗原合成
1.2 方法
1.2.1 滴滴涕半抗原的制备
取1.7g邻氯苯乙酸,加5mL氯苯,再加入1.8g水合氯醛,加热至完全溶解后,加入三氯化铝5.38g,室温搅拌5h,停止反应,加水80mL和乙酸乙酯120mL,萃取分离,分去水相,有机相无水硫酸钠干燥蒸干,得到黄色油状物,上硅胶柱,石油醚/乙酸乙酯(v/v,1/1)洗脱分离,得到乙酸滴滴涕半抗原产物1.8g,收率43.9%。
1.2.2 免疫原的制备—滴滴涕半抗原与牛血清白蛋白(BSA)偶联物合成
取乙酸滴滴涕半抗原产物15mg,加DMF1mL,溶解澄清,加EDC13.7mg和NHS10.9mg,充分混匀后,反应4h,得到半抗原活化液A液;取牛血清白蛋白(BSA)50mg,加0.05M PB溶解,得到B液。将A液滴加到B液中,4℃反应24h后0.02M PBS透析纯化3天,每天换液3次,得到滴滴涕-BSA偶联物,即免疫原,分装后于-20℃保存。
图2 滴滴涕胶体金试纸条结果判定示意图
1.2.3 免疫原的制备—滴滴涕半抗原与卵清蛋白(OVA)偶联物合成
取乙酸滴滴涕半抗原产物9mg,加DMF1mL,溶解澄清,加EDC7.6mg和NHS6.8mg,充分混匀后反应4h,得到半抗原活化液A液;取卵清白蛋白(OVA)50mg,加 0.05M PB溶解,得到 B液。将A液滴加到B液中,4℃反应24h后0.02M PBS透析纯化3天,每天换液3次,得到滴滴涕-OVA偶联物,即免疫原,分装后于-20℃保存。
1.2.4 将滴滴涕单克隆抗体-胶体金标记物冻干到微孔试剂上
将滴滴涕单克隆抗体-胶体金标记物加入到微孔板中,冷冻干燥,得到滴滴涕单克隆抗体-胶体金标记物冻干的微孔试剂[15-16]。
1.2.5 检测方法
向微孔中加入100μL待检样本溶液,混匀,室温下培育3min。吸取70μL溶液滴至试纸条上,反应10min,根据示意图判定结果或通过胶体金分析仪读取检测结果[15-16]。
1.2.6 样本检测限
在空白蔬菜、水果、饲料、牛奶样本中分别添加滴滴涕标准品至质量浓度为0、4、4.5、5、5.5、6μg/L,按照“1.2.5”所述方法用3批试纸条进行检测,每个浓度重复5次,根据实验结果确定样本检测限[15-16]。
1.2.7 试纸条的特异性
分别配制500μg/L的五氯硝基苯、百菌清和溴氰菊酯等药物,用胶体金免疫快速检测试纸条进行检测,重复测定3次,判断试纸条的特异性[15-16]。
1.2.8 准确性
农业部文件要求:以假阳性率和假阴性率表示胶体金免疫层析法的准确性[15-16]。取经过仪器确证的50份阴性蔬菜、水果、饲料、牛奶样品(质量浓度小于5μg/kg)与50份阳性蔬菜、水果、饲料、牛奶样品(质量浓度大于5μg/kg),用胶体金免疫快速检测试纸条检测滴滴涕的残留量,计算假阳性率和假阴性率[15-16]。《农残办技术材料要求及审查程序》规定:试纸条假阳性率应小于5%,假阴性率应为零[15-16]。
表1 滴滴涕快速检测试纸条的检测限
表2 特异性测定
1.2.9 试纸条的稳定性
将试纸条保存于2~8℃环境中,每隔1个月检测试纸条的准确性,连续测定15个月[15-16]。具体方法为:分别检测经过仪器确证的20份阴性蔬菜、水果、饲料、牛奶样品(质量浓度小于5μg/kg)与20份阳性蔬菜、水果、饲料、牛奶样品(质量浓度大于5μg/kg),重复测定2次,根据实验结果判定试纸条的稳定性[15-16]。
2 结果与分析
2.1 样本检测限
配置滴滴涕浓度分别为0、4、4.5、5、5.5、6μg/L的蔬菜、水果、饲料、牛奶样品,按照“1.2.5”步骤进行检测,确定检测限[15-16]。结果显示,该试纸条的检测限为5μg/kg,见表1。
2.2 特异性
用试纸条检测500μg/L的五氯硝基苯、百菌清和溴氰菊酯等药物,结果均呈阴性(见表2),表明该试纸条特异性较好[15-16]。
2.3 准确性
用试纸条检测50份阴性蔬菜、水果、饲料、牛奶样品,检测结果均为阴性,说明假阳性率低于5%;用试纸条检测50份阳性蔬菜、水果、饲料、牛奶样品,检测结果均为阳性(见表3),说明该试纸条假阴性率为零,符合《农残办技术材料要求及审查程序》要求[15-16]。
表3 准确性测定
2.4 稳定性
试纸条保存12个月内,其假阳性率和假阴性率的检测结果均符合要求;之后试纸条会出现少量失效、假阴性等现象[15-16](见表4)。
3 讨论
目前,有关检测滴滴涕的文献较为有限,本研究通过制备滴滴涕半抗原,让其与载体蛋白偶联得到免疫原,最终制备出商品化的胶体金免疫层析试纸条。按照《农残办技术材料要求及审查程序》要求,对试纸条进行了特异性、准确性、稳定性等性能测试,均符合要求。此外,该试纸条的检测时间仅为15min,比现有文献中仪器方法用时更短,操作更简便。