基于Cocktail探针药物法分析辛伐他汀对肝脏药物代谢酶的影响

李松 陈君

辛伐他汀是常用的调节血脂的药物之一，广泛地应用于高血压的临床治疗中[1]。辛伐他汀通过选择性抑制肝脏中胆固醇合成的限速酶——HMG-CoA还原酶，从而降低胆固醇的水平[2]。但是辛伐他汀在作为治疗药物，与一些药物合并用药时，会出现不良反应[3]。辛伐他汀主要经CYP3A4代谢，而CYP450的酶活性是药物之间产生相互作用的重要机制之一[4]。本研究通过研究辛伐他汀对CYP450酶体内代谢活性的影响，为药物相互作用研究提供参考，促进临床合理用药。

资料与方法

一、药品与仪器

睾酮，批号100008-201206；奥美拉唑，批号100367-201305；美托洛尔，批号100084-20140，卡马西平，批号100142-201105，均购自中国药品生物制品检定所；非那西汀，批号WXBB5767V；甲苯磺丁脲，批号MKBR6717V；氯唑沙宗，批号SLBD9318V，均购自Sigma公司，美国；乙腈，质谱纯，德国Merck公司生产；超纯水，Millipore Q自制。UPLC-Xevo TQD MS (超高效液相色谱-TQD质谱联用仪)，ACQUITY系统，配置在线脱气机、二元梯度泵、柱温箱、自动进样器，美国Waters公司。

二、实验动物

雄性SD大鼠，体质量220±20g，实验动物购自北京维通利华实验动物技术公司，实验动物生产许可证号：SCXK(京)2016-0006。饲养条件为：温度，20±2 ℃；湿度，60%±5%；12 h昼夜交替。

三、实验方法

(一)标准溶液配制 各探针药物溶液配制：分别制备浓度为1 mg/ml的非那西汀、甲苯磺丁脲、美托洛尔、奥美拉唑、氯唑沙宗和睾酮的储备溶液，均以乙腈作为溶剂。以乙腈为溶剂采用倍比稀释法稀释各探针药物的储备液，甲苯磺丁脲稀释成浓度为50、20、10、5、2、1、0.5、0.2、0.1 μg/mL的工作液，氯唑沙宗稀释成浓度为100、50、20、10、5、2、1、0.5、0.2、0.1 μg/mL的工作液，其余探针药物稀释成浓度为10、5、2、1、0.5、0.2、0.1、0.05、0.02 μg/mL的工作液，保存于4 ℃冰箱。内标溶液的配制：精密称取卡马西平，配制成浓度1 mg/mL的储备液，稀释成2 μg/mL的工作液，保存于4 ℃冰箱。

(二)Cocktail探针药物溶液的配制 准确称取探针药物非那西汀22 mg，甲苯磺丁脲4.4 mg，美托洛尔、奥美拉唑、氯唑沙宗和睾酮各44 mg溶于4 mL无水乙醇，将无水乙醇缓缓加入18 mL生理盐水中，配制成Cocktail探针药物溶液。

(三)UPLC-TQD条件 色谱柱：Xbridge BEH C18 色谱柱 (2.1×50 mm, 2.5 μm)；流动相：0.5‰HCOOH-H2O (A), 0.5‰HCOOH-ACN (B)；流速：0.6 mL/min,；柱温：40 ℃；梯度洗脱：0～1.5 min, 5%B; 1.5～3.5 min, 5%～45%B; 3.5～8.0 min, 45%～100%B; 8.0～11.0 min, 100%。离子化方式：电喷雾离子化(ESI)；离子检测模式：多反应离子检测模式 (MRM)。采用ESI正离子模式对非那西汀、甲苯磺丁脲、美托洛尔、奥美拉唑和睾酮进行定量；ESI负离子模式对氯唑沙宗进行定量。主要质谱参数：毛细管电离电压3.2 kV，离子源温度150 ℃ ，去溶剂气N2，流速700 L/h，去溶剂气温度450 ℃。

(四)样品预处理 取大鼠血浆样本100 μL，加入内标溶液10 μL(终浓度为0.2 μg/mL)，加入300 μL乙腈，涡旋2 min，12 000 rpm离心15 min，取上清液于另一EP管中，置于真心离心浓缩仪中挥干，100 μL 50%甲醇溶液复溶，取3 μL进样分析。

(五)方法学验证 特异性和标准曲线：取6个来自不同大鼠的空白血浆样品，通过考察空白生物样品色谱图、空白生物样品外加探针药物色谱图及给药后的生物样品色谱图，以反映本分析方法的特异性。分别取不同浓度的探针药物工作液配制为混标，经过样品预处理后，绘制标准曲线。

(六)实验分组及给药方法 将大鼠分为空白对照组和辛伐他汀组，每组6只，分别灌胃给予生理盐水和辛伐他汀(4 mg/kg)，每日1次，连续给药7 d；第8天灌胃给予“Cocktail”探针药物溶液0.5 ml/100 g，剂量分别为非那西汀5 mg/kg ，甲苯磺丁脲1 mg/kg，氯唑沙宗，美托洛尔，奥美拉唑，睾酮10 mg/kg。

(七)血浆样品采集 分别于灌胃给予探针药物前及给药后5, 15, 30 min, 1, 2, 3, 4, 6, 8, 12, 24 h眼内眦静脉取血约0.5 mL至肝素化离心管中，3 500 rpm离心10 min，分离血浆，保存于-20 ℃冰箱待测。

三、实验数据处理

采用Drug And Statistics Version 3.0(DAS 3.0)软件计算各项药代动力学参数，包括：达峰浓度(Cmax)、血药浓度-时间曲线下面积(AUC0-t)、消除半衰期(t1/2)和清除率(CL)；实验数据均以平均值±标准差表示。采用SPSS 14.0软件进行统计分析，两组间药代参数进行独立样本t检验分析，P<0.05有统计学意义。

结 果

一、UPLC-MS方法学验证

血浆中非那西汀、甲苯磺丁脲、美托洛尔、奥美拉唑、氯唑沙宗、睾酮及内标色谱峰峰型对称，分离度高，且无其他杂质干扰；血浆中各探针药物的线性范围, 回归方程和r值见表1。

表1 血浆中各探针药物的线性范围, 回归方程和r值

二、Cocktail探针药物血浆浓度测定结果

采用DAS3.0药代动力学软件对大鼠灌胃Cocktail探针药物后的血药浓度-时间数据进行处理，计算其药代动力学参数值，结果显示辛伐他汀组中非那西汀的Cmax和AUC0-t均显著低于空白对照组，CLz/F显著高于空白对照组(P<0.05)；辛伐他汀组中氯唑沙宗、甲苯磺丁脲和睾酮的Cmax和AUC0-t均显著高于空白对照组，CLz/F显著低于空白对照组(P<0.05)；辛伐他汀组和空白对照组中美托洛尔和奥美拉唑的Cmax、AUC0-t和CLz/F之间无显著性差异(P>0.05)。见表2。

表2 大鼠灌胃给予Cocktail探针药物后两组主要的药动学参数

讨 论

CYP450酶参与了大多数内源性和外源性化合物的代谢，药物的代谢速率和清除率依赖于其活性，但是CYP450酶可被多种药物抑制或诱导，从而产生药物-药物相互作用，使得药效降低或发生药物不良反应[5]。其中CYP450酶亚型包括CYP1A2、CYP2C9、CYP2C19、CYP2B6、CYP2E1、CYP3A4主要参与外源性药物的代谢，且临床上大部分药物是经这些酶亚型代谢[6]。因此本研究选择以上述酶亚型为研究对象，探讨辛伐他汀对CYP450酶活性的影响。

目前研究药物对CYP450酶活性的方法主要有探针药物法和基因分型法。Cocktail探针药物法是一次给予两种以上探针药物，评价药物代谢酶活性的方法。相对于单一探针药物评价方法相比，其具有可以降低个体间和个体内代谢酶活性差异的影响，同时还可以降低成本，缩短实验时间等[7]。

本研究利用Cocktail探针药物法研究辛伐他汀对CYP450酶活性，结果显示辛伐他汀组中非那西汀的Cmax和AUC0-t均显著低于空白对照组(P<0.05)；辛伐他汀组中氯唑沙宗、甲苯磺丁脲和睾酮的Cmax和AUC0-t均显著高于空白对照组(P<0.05)；辛伐他汀组和空白对照组中美托洛尔和奥美拉唑的Cmax和AUC0-t之间无显著性差异(P>0.05)。结果提示伐他汀对大鼠的CYP1A2有诱导作用，对CYP2C9、CYP2E1和CYP3A4有抑制作用，而对CYP2C19和CYP2D6无显著性影响。他汀类药物是临床上广泛使用的降血脂药物，能减少内源性胆固醇的生物合成。辛伐他汀能有效地减少总胆固醇的水平，是治疗高胆固醇患者的首选药物之一[2]。辛伐他汀口服吸收后，其代谢产物具有活性，因此与一些药物合并用药时，会出现不良反应。辛伐他汀在与一些药物联用时，会影响其他药物的体内药代动力学参数，可能会造成这些药物的药效降低或不良反应的增加。如张师[8]对辛伐他汀对大鼠体内的吉非替尼药代动力学影响进行了研究，结果显示辛伐他汀会对吉非替尼的药代参数造成影响。另有研究显示辛伐他汀会显著影响格列吡嗪的药代动力学参数，造成其在血浆中暴露量明显减少[9]。

综上所述，本研究提示辛伐他汀应减少与其他通过CYP1A2、CYP2C9、CYP2E1和CYP3A4酶代谢的药物同时使用，如同时使用需加强用药监测，防止药物相互作用可能造成的用药不良反应。本研究结果可指导辛伐他汀相关的临床合理用药，为进一步研究药物-药物相互作用提供了基础。