谷胱甘肽的宽频太赫兹光谱研究

2020-10-22朱中杰沈建雄张宗昌张建兵赵德明赵红卫

分析化学 2020年10期

郭聪朱中杰沈建雄张宗昌张建兵赵德明赵红卫*

1(浙江工业大学化工学院，杭州 310014) 2(中国科学院上海高等研究院张江实验室，上海 201210) 3(中国科学院上海应用物理研究所，上海201800)

1 引言

太赫兹时域光谱(THz-TDS)是基于飞秒激光技术发展起来的一种新型光谱技术，其信噪比高，可有效探测分子低频振动、分子间弱相互作用以及晶格振动等[11～13]。太赫兹波能量低，不会对生物分子造成电离损伤，被广泛应用于生物分子如核酸和蛋白质等的结构分析以及分子相互识别的研究[14～16]。Nibali等[17]利用分子动力学模拟酪氨酸磷酸酶PDZ结构域的变构过程和酶与RAGEF2短肽形成复合物前后的太赫兹光谱，结果表明，配体的亲和力和结合模式能调节PDZ结构域的变化，使蛋白质功能改变，并引起不同的太赫兹共振响应。蛋白质的生物学功能与其构象的多样性和复杂性有关，而蛋白质中肽链以及氨基酸单元通过非共价键影响蛋白质的构型构象，因此多肽构型构象的研究至关重要。Yamamoto等[18]采用光电导THz-TDS研究GSSG，结果表明，GSSG对太赫兹波呈无特征吸收。Rutz[19]和Wang[20]等利用光电导天线THz-TDS对GSH进行测量，分别获得了室温下0.12～2.0 THz和0.3～2.4 THz波段的吸收光谱，并利用单分子模拟对光谱进行分析。由于该理论模拟方法未考虑分子间的相互作用，导致实验光谱与理论光谱的吸收峰位移不完全吻合。GSH和GSSG的宽频太赫兹光谱有助于加深了解分子的振动性质以及具有生物学活性的分子构型构象变化特点。本研究采用空气等离子体宽频THz-TDS系统对GSH和GSSG进行探测，在室温条件下获得0.5～12.0 THz波段的光谱信号。利用密度泛函渐论(DFT)对GSH在太赫兹波段吸收光谱进行理论计算和振动模式分析，深入了解氢键对GSH分子的构型构象和排列方式的影响机制。GSH有多种晶型结构[21～24]，考虑到不同晶型结构对太赫兹响应的差异，本研究采用粉末X射线衍射(PXRD)对样品晶型进行测量表征。

图1 (A)还原型和(B)氧化型谷胱甘肽的分子结构Fig.1 Molecular structures of (A) reduced glutathione (GSH) and (B) oxidized glutathione (GSSG)

2 实验部分

2.1 仪器与试剂

基于空气等离子体的TA-800宽频太赫兹光谱仪(Terahertz Photonics公司)，用于探测样品0.5～12.0 THz范围内的太赫兹吸收光谱。采用掺钛蓝宝石激光放大系统(美国 Spectra-Physics公司， Spitfire Ace)作为光源，入射激光的中心波长为800 nm，脉冲宽度小于35 fs，重复频率为1 kHz，用于激发太赫兹的泵浦脉冲能量约为0.9 mJ，检测的脉冲能量约为80 μJ，偏置相电压为1.5 kV。利用基于光电导开关8-F共焦THz-TDS系统(自建)测量样品0.2～2.8 THz范围的太赫兹吸收光谱，采用掺钛蓝宝石激光系统(美国 Spectra-Physics公司, Mai Tai)作为光源，入射激光的中心波长为800 nm。两套TDS系统的信噪比均大于1000∶1。采用X射线多晶衍射仪(德国 Bruker公司)探测样品在10°～90°范围内的PXRD衍射图。

GSSG和GSH(纯度98%，百灵威化学技术有限公司); 衬底材料为环烯烃共聚物(COC，上海原子核研究加工厂)，粒径小于100 μm，此衬底材料在13 THz以下的吸收对样品测量的影响可以忽略[25]。

2.2 实验方法

2.2.1 THz-TDS测量样品制备衬底与被测样品以合适比例在研钵中充分混合均匀后，用压片机在2 MPa的压力下将粉末压成直径13 mm、厚度0.7 mm的样片。

太赫兹光谱的探测飞秒光被分束片分为两束，光束经透镜和BBO倍频晶体作用产生二次谐波脉冲后与基频光束在空气中聚焦，聚焦区的空气产生等离子体进而辐射出宽带太赫兹激光脉冲[26]。太赫兹激光脉冲经分束镜分为泵浦光和探测光。两束光在样品中共线聚焦，产生新的二次谐波脉冲。用光电倍增管(PMT)探测经400 nm带通滤波器筛选出带有样品信号的二次谐波脉冲。太赫兹场振幅与该谐波光束能量的平方根成正比，因此，可以将PMT测得信号进行处理以获得太赫兹信号[27]。探测光焦点处的电极引入外部偏置电压，用于相干检测。

2.2.2 PXRD实验PXRD实验采用X射线源为铜靶，工作电压为40 kV，工作电流为40 mA，扫描速度0.2°/s，扫描范围为10°～90°(2θ)。

2.3 参数计算

太赫兹时域光谱采集的信号是包含样品相位和幅值信息在内的单位脉冲的时域信号。该信号经过傅立叶变换可以获得样品的折射率、介电常数和吸收系数。实验测得以空气为参考背景的信号Pref(ω)和样品信号Psan(ω)。两个信号通过快速傅立叶变换，时域信号转换成为对应的频域信号，具体变换公式如下：

(1)

其中，TLinear(ω)为透过率(%)，Psan(ω)为样品的电场能量光谱，Pref(ω)为样品背景的能量光谱：

(2)

(3)

(4)

(5)

(6)

(7)

其中，α(ω)是吸收系数(cm-1)，k(ω)为消光系数，ω为角频率(rad/s);c为光速(m/s)。

3 量子化学计算

考虑到本研究是在室温下探测GSH的太赫兹吸收光谱，且利用PXRD测量所获的GSH衍射谱与文献中295 K温度[24]下测量结果一致，因此选用295 K温度下的晶胞参数(斜方晶系，空间群P212121，a=5.6216(4)，b=8.7855(6)，c=28.0552(18)Å)为理论计算初始值，进行分子的结构优化和太赫兹光谱计算及振动分析。本研究采用Materials Studio中以密度泛函理论(DFT)为基础的CASTEP模块进行量子化学计算，平面波截止能量为600 eV。选择广义梯度近似的Perdew-Burke-Ernzerhof(GGA-PBE)作为电子与电子交互和相关效应的计算，并采用Grimme下用色散修正项校正PBE泛函的PBE-D2方法[28]; 利用4×2×1 Monkhorst-Pack K点网格进行几何优化和太赫兹理论光谱计算。

图2 利用空气等离子体宽频太赫兹系统获得的0.5～12.0 THz 范围内GSH和GSSG太赫兹吸收光谱，插图为利用光电导开关8-F共焦太赫兹系统(系统Ⅱ)获得的0.2～2.8 THz 范围内GSH和GSSG太赫兹吸收光谱(图中阴影部分仅供参考)Fig.2 Terahertz absorption spectra of GSH and GSSG in the range of 0.5-12.0 THz obtained by the broadband air plasma terahertz system.Spectra in inset are obtained by the photoconductive switch 8-F confocal terahertz system (The shaded parts in the graph Ⅱ are only for reference)

4 结果与讨论

4.1 GSH和GSSG宽频太赫兹吸收光谱

图3 GSH和GSSG的PXRD衍射图Fig.3 Powder X-ray diffraction (PXRD) patterns of GSH and GSSG

图2为GSH和GSSG在0.5～12.0 THz波段的吸收光谱。GSH在1.52、2.51、3.71、4.38、5.02、5.96、6.67、7.10、8.23、9.03、10.11和10.71 THz处有特征吸收峰(红线)，其中5.96和10.71 THz处吸收峰的吸收强度较大，且峰形尖锐。而GSSG呈现的则是一条单调上升的吸收曲线(蓝线)，没有明显的特征吸收峰。由于0.5～1.4 THz波段的信息受仪器检测限影响，利用在低频太赫兹区域有较高分辨率的光电导开关太赫兹系统探测0.2～2.8 THz范围内GSH和GSSG的太赫兹吸收光谱(图2插图)。测量结果表明，0.2～2.8 THz波段GSH的太赫兹吸收峰与文献[19,20]报道结果吻合，而GSSG依然对太赫兹波呈现无特征吸收。在之前晶体和非晶体系的太赫兹光谱研究中也观察到类似现象。Walther等[29]利用THz-TDS检测晶体和非晶葡萄糖的太赫兹吸收光谱，结果表明，由于晶体中糖分子的非共价键与太赫兹波产生协同共振响应，导致晶体糖在太赫兹波段有明显的特征吸收峰，而非晶糖在太赫兹波段呈无特征吸收曲线。太赫兹吸收光谱还与氢键的作用特点密切相关，生物分子的特定晶型通常是分子在氢键的定向作用下有序堆叠而成[30,31]。当太赫兹光与分子晶体作用时，特定波段太赫兹的能量与晶格和氢键振动能量匹配，分子产生共振响应，进而呈现特征吸收峰。非晶物质内，分子通常不能按照一定规律有序排列，且存在氢键取向随机的现象，容易导致非晶物质对太赫兹波呈现单调递增的无特征吸收[32]。为了进一步验证不同样品存在形式对太赫兹响应的影响，采用PXRD衍射对GSH和GSSG进行了表征。图3为GSH和GSSG的PXRD衍射图，其中GSH有一系列较强的尖锐衍射峰，说明样品具有晶型结构; 而GSSG在所测范围内没有出现衍射峰，说明GSSG没有特定的晶型结构，是无定形态。GSH和GSSG的PXRD检测结果与太赫兹检测结果一致，说明太赫兹光谱对物质晶体结构有敏感响应[33]。

图4 GSH的实验和理论计算的太赫兹光谱Fig.4 Experimental and calculated Terahertz spectra of GSH

4.2 GSH太赫兹光谱理论分析

量子化学理论计算是解析实验获得的太赫兹光谱的一种有效方法[37,38]。考虑到GSH的晶体结构具有温度敏感性[24]，本研究采用295 K温度下的GSH初始晶胞参数进行结构优化和振动分析。图4为理论计算获得的GSH太赫兹光谱(蓝色虚线)，并将其与实验获得的光谱(红色实线)比对分析。理论计算获得的太赫兹光谱中吸收峰的数量比实验光谱中的多，特别是在低频区域较明显，这一现象与低频区域复杂的集体振动、分子间和分子内振动耦合以及实验测量仪器的检测灵敏度和分辨率等因素有关[39,40]。同时，与理论计算得到的光谱相比，实验光谱中的吸收峰有一定偏移，低频区的偏移量较小而高频区吸收峰的偏移量较大。由于实验中的测量样品是未经进一步纯化的粉晶，会对吸收峰位移产生一定影响[41]。此外，理论计算的温度是 0 K，而实验测量的环境温度为295 K，此温度差异引起的晶格膨胀在一定程度上使得吸收峰发生偏移[42]。同时，仪器测量的环境因素如温度和湿度等也会对吸收峰产生一定影响。