食管腺癌细胞系及模型和3D培养的研究进展

刘董剑，杨 凌

(1.内蒙古医科大学 研究生院，内蒙古 呼和浩特 010110；2.内蒙古医科大学附属医院 临床医学研究中心，内蒙古 呼和浩特 010050；3.内蒙古自治区医学细胞生物学重点实验室，内蒙古 呼和浩特 010050)

1 食管腺癌生物学特点

食管癌(esophageal carcinoma)是一种恶性侵袭性疾病，是癌相关致死性的常见原因之一，每年有多达几十万人死于这种癌。食管腺癌(esophageal adenocarcinoma,EAC)在人群中的发病率较低，仅占食管癌的小部分。食管腺癌易发生于低位食管内，部分食管腺癌来自Barrett食管，其他来自食管内腺体的恶变。食管腺癌恶性程度不一，常分为低分化、高分化两种类型腺癌。早期食管癌患者往往无明显症状，易发生淋巴结转移和远处转移，造成食管腺癌晚期患者不易治愈。食管反流物造成的炎性反应会刺激食管内膜化生，是常见的导致食管腺体恶变的因素之一，同时，遗传因素、环境因素及饮食习惯等因素也都与食管腺癌的发生发展密切相关。高通量基因测序发现，食管腺癌细胞内基因组序列常伴发基因突变、缺失、重组及DNA甲基化。食管腺癌的染色体非常不稳定，易造成基因编码错误及表达异常。此外。亚硝酸盐、高热食物等因素也容易导致食管腺细胞内DNA损伤及修复错误而增加突变频率，造成食管腺细胞增殖异常及恶变。由此可知，肿瘤基因和分子水平调节异常对肿瘤的性质和侵袭性具有高度影响和相关性。

食管腺癌(esophageal adenocarcinoma)的增殖、分化、凋亡、远处转移及侵袭性，会受到细胞内信号传导途径传导及调节因子表达的影响。随着对食管肿瘤研究的推进，分子靶向药物广泛用于肿瘤的治疗，Trastuzumab 和Ramucirumab是常用于治疗食管腺癌的分子靶向药物，其机制是通过抑制表皮生长因子受体及血管生长因子受体而抑制肿瘤的转移，从而达到治疗肿瘤的目的。此外，治疗食管腺癌的方法还包括手术治疗、放化疗及免疫治疗，但食管腺癌患者病死率依然很高。由于食管腺癌很难治愈，远处转移的概率很大，食管癌的科学研究和临床治疗依旧是一项艰巨任务。

因此，为了探索和研究食管腺癌细胞的生物特性及发生机制，食管腺癌模型的3D培养可以用于发现腺癌细胞潜在的微观变化及癌变机制。本文综述了近年来食管腺癌细胞系、移植模型、3D培养研究的最新成果。

2 食管腺癌细胞系

食管腺癌细胞系包括SKGT、OE、FLO-1、Eso及OACM 5.1C亚系。SKGT-4、SKGT-2是高分化腺癌， SKGT-5、OE19、FLO-1、ESO51、OE33、Eso26、EsoAd1及OACM 5.1C是低分化食管腺癌。食管腺癌细胞是会发生高度变异和分子水平表达异常的肿瘤。食管腺癌细胞在增殖及分化过程中易产生异质性，形成不同程度的结构及形态差异。同时，食管腺癌细胞易通过血管进入周围循环而形成循环肿瘤，可被认为是肿瘤细胞转移性播散的前兆。构建腺癌培养模型将成为食管腺癌研究和临床治疗的有利工具，特别有利于研究食管腺癌异质性和可塑性。食管腺癌细胞系亚型各自的特点见表1。

表1 食管腺癌细胞系特点Table 1 Characteristics of esophageal adenocarcinoma cell lines

2.1 低分化食管腺癌细胞系

OE19是食管腺癌细胞系亚型，呈现高度分化。腺癌细胞内常存在基因扩增或表达异常，并与肿瘤细胞所处的微环境密切相关。OE19细胞内PIK3CA基因呈现扩增，与肿瘤浸润性T细胞显著相关，KRAS扩增与淋巴结阳性患者和较差的总体生存率相关。PIK3CA或KRAS的基因扩增会诱导下游区域的AKT-mTOR或RAF-ERK通路的活化，而活化的AKT通路与炎性肿瘤微环境有关[1]。肿瘤的进展与食管腺癌周围微环境的变化密切相关。因此，肿瘤微环境会影响肿瘤细胞的增殖及转移，调节肿瘤微环境有利于推进肿瘤的治疗及改善疗效。辛伐他汀通过抑制COX-2和PGE2的表达而对OE-19腺癌细胞具有明显的抑制作用，随MDA水平的升高而升高。辛伐他汀对食管腺癌的治疗可能具有重要的作用[2]。

OE33是低分化食管细胞系亚型。机体免疫应答对识别和杀死肿瘤起重要作用，而免疫功能异常容易导致肿瘤的发生。免疫检查点抑制可能影响高度侵袭性癌细胞的增殖。miRNAs的过度表达会降低TAP1、TAP2的表达及细胞表面MHC-I的表达， 高表达量的TAP1和抗原提呈相关基因能促进调节适应性免疫应答基因PD-L1、PD-L2和IDO1的高水平表达。OE33腺癌细胞内MIR125a-5p和MIR148a-3p水平的增加可以降低抗原提呈所需的TAP2和MHC-I水平，EAC细胞内高表达的MHC-I分子可显著缩短患者的总生存时间[3]。肿瘤细胞内小分子信号物质及表达会发生变化。microRNAs在许多恶性肿瘤相关的生物学过程中发挥着重要作用，包括细胞凋亡、代谢、增殖和分化[4]。miR-126是OE33细胞活性的调节因子。miR-126的稳定表达能显著改变细胞凋亡和DNA修复相关基因的表达，及调节促凋亡和抗凋亡基因TP53和GATA6的表达。食管腺癌细胞内miR-126高表达可阻滞肿瘤细胞凋亡，并与患者生存率低有关[5]。

FLO-1是低分化食管腺癌细胞系亚型。RAD51是介导同源重组的DNA修复机制，在维持基因组完整性和稳定性方面起着关键作用。FLO-1腺癌细胞内RAD51的表达升高与DNA断裂的修复和基因组重排有关，而中度抑制该基因可降低同源重组活性，然而强烈或甚至接近完全抑制该基因会激活涉及SSA机制、与RAD51C相关的同源重组活性。SSA是一种致突变的同源重组途径，通过增加肿瘤细胞内DNA断裂进一步破坏基因组完整性。RAD51是治疗某些癌的潜在靶点[6]。TLRs是机体免疫系统的组成部分，与FLO-1细胞的增殖密切相关。通过TLR4-MyD88-TRAF6-NF-κB信号通路，TLR4激活会促进肿瘤细胞增殖，而抑制NF-κB的途径会导致降低肿瘤细胞的增殖速度。TLR4可能是抑制食管癌细胞增殖的靶点，对肿瘤的研究和治疗具有重要价值[7]。

ESO51是食管腺癌细胞系亚型。ESO51细胞内存在上皮间质转化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)因子或HER2的过表达，与肿瘤的发展具有相关性。福林替尼对ESO51细胞的增殖具有明显的抑制作用，达到EMT基因扩增和过表达的水平。福林替尼或siRNA特异性下调EMT表达会抑制EMT信号传导诱导的ESO51细胞凋亡。HER2的异位表达会降低福林替尼对ESO51-HER2细胞介导的增殖抑制作用及ERK下游磷酸化[8]。福林替尼和拉帕替尼可有效抑制EMT和HER2磷酸化，通过诱导细胞凋亡增强对肿瘤细胞增殖的抑制作用，显著提高整体的生存率。福林替尼和拉帕替尼对HER2阳性的EMT过度表达EAC患者的治疗可成为一种新的治疗肿瘤的策略[9]。

Eso26是食管腺癌细胞系亚型。肿瘤细胞内的信号分子受到抑制或放大，可影响肿瘤细胞的增殖、凋亡。CDK9抑制剂具有抗肿瘤作用，MCL-1是CDK9抑制剂的下游靶点。通过抑制HIF-1α与MCL-1启动子结合，BAY1143572会下调MCL-1，并具有抗肿瘤增殖和促凋亡作用。5-FU能够增强BAY1143572诱导MCL-1的下调，MCL-1的稳定过表达会降低BAY1143572和5-FU诱导的ESO26细胞凋亡。MCL-1是EAC治疗的一个预测因子，与肿瘤患者的生存期密切相关[10]。SOX9是肿瘤治疗的一个预后标志物，对肿瘤细胞的增殖和凋亡具有重要影响。通过抑制肿瘤细胞增殖及促进肿瘤细胞凋亡，SOX9基因敲除能提高ESO26细胞对Trastuzumab的作用，并可以抑制AKT磷酸化。SOX9可能通过激活磷脂酰肌醇-3-激酶/AKT信号通路而产生曲妥珠单抗抗性作用[11]。

EsoAd1是食管腺癌细胞系亚型。EsoAd1细胞内AR的核定位区和FKBP5的表达与食管癌患者生存率降低有关。FKBP5的表达与肿瘤细胞增殖呈正相关，FKBP5阳性细胞比例高的EAC细胞增殖指数高。二氢睾酮(dihydrotestosterone，DHT)会诱导 FK506基因的表达，DHT通过肿瘤细胞内AR抑制增殖、细胞分裂、诱导细胞周期阻滞及细胞凋亡。肿瘤细胞内的信号途径异常激活与肿瘤的进展具有重要联系。DHT会抑制肿瘤细胞增殖、分化及诱导抗原相关基因表达和细胞周期停滞[12]。

OACM 5.1C是食管腺癌细胞系亚型。OACM 5.1C细胞内galectin-9具有抗增殖作用。Gal-9可以诱导肿瘤细胞凋亡，增加细胞内caspase裂解的角蛋白18的表达水平、活化caspase-3及caspase-9。Gal-9能升高IL-8表达水平，显著改变miRNA的表达，但不会通过降低细胞周期相关蛋白水平而促进细胞周期阻滞。因此，该研究对于EAC的临床治疗具有重要意义[13]。

SKGT-5是食管腺癌细胞系亚型。SKGT-5细胞内Notch信号会驱动表皮细胞的自我更新。SKGT-5存在完整激活肿瘤细胞内Notch的信号通路，肿瘤细胞内会表达NOTCH1-3，但不表达NOTCH4，暗示存在一个活跃的Notch信号通路[14]。食管腺癌内Rb、细胞周期蛋白D1、p16和p53基因的表达会发生变化。氟哌利多会诱导SKGT-5细胞周期阻滞和凋亡，细胞内周期蛋白D1、Rb和p107蛋白水平的表达会下降。细胞周期阻滞和肿瘤生长抑制与肿瘤细胞的基因型没有明显的相关性，氟哌利多对食管癌的治疗很有前景[15]。

2.2 高分化食管腺癌细胞系

SKGT-4是高分化食管腺癌细胞系亚型。食管腺癌细胞内存在LncRNA XIST过度表达。XIST的表达可以显著抑制SKGT-4细胞的增殖、迁移和侵袭，并诱导凋亡。肿瘤细胞内miR-494表达下调，会抑制p-JAK2和p-STAT3表达增加。XIST的异常表达可能通过JAK2/STAT3信号通路的miR-494/CDK6轴在食管癌的发生发展中起致癌作用，为肿瘤细胞的分子机制研究提供理论依据[16]。SIX3是一种人类细胞内的转录因子。SKGT-4细胞内SIX3高表达，与食管癌低存率有关，SIX3基因的敲除显著抑制肿瘤细胞的增殖、迁移和侵袭。si-SIX3转染肿瘤细胞后，PI3K/Akt信号通路中一些关键蛋白的表达明显降低，可能导致PI3K/Akt信号失活。研究结果表明，SIX3对人肿瘤细胞具有潜在促进作用，可能是预测食管癌患者预后的生物标志物和治疗靶点[17]。SKGT-2是食管腺癌细胞系亚型。SKGT-2细胞缺乏Rb表达，而肿瘤细胞内cyclin Dl 和活性p16 呈现中度表达[15]。

3 放化疗抗性模型

肿瘤细胞对放化疗的敏感性差异很大，易导致放疗抗性。放化疗也会改变肿瘤细胞结构及遗传物质而产生适应性，从而影响治疗效果。尽管有很多种方法治疗肿瘤，但效果都不是很理想。放化疗仍是治疗肿瘤的常用方法。放化疗模型不仅可以研究和探索肿瘤细胞抗性的原因，也有助于研究和探索肿瘤细胞基因信号通路及细胞因子调节的相关机制。食管腺癌抗性细胞系总结见表2。

表2 食管腺癌细胞系抗性特点Table 2 Resistance characteristics of esophageal gland cancer cells

3.1 化疗抗性模型

OE19-ERBB和OE33-ERBB是食管腺癌细胞系亚型，会对曲妥珠单抗和帕妥株单抗产生抗性。肿瘤细胞内ERBB3呈高表达，TGFB1与ERBB3表达呈负相关。存在Trastuzumab培养的EAC细胞会降低上皮标志物表达，增加间充质标志物表达。不存在Trastuzumab培养的肿瘤细胞，会诱导EMT。与ERBB抑制剂培养的EAC细胞会分泌TGFβ受体配体，并导致EMT的发生。与曲妥珠单抗、帕妥株单抗培养的肿瘤会表达EMT标记，且肿瘤细胞分化较差，而存在曲妥珠单抗、帕妥株单抗及TGFβ抑制剂联合作用培养的肿瘤细胞会表达上皮标记，肿瘤细胞分化程度较高。OE19或33细胞是通过激活TGFβ信号通路，对Trastuzumab和Pertuzumab产生抗药性，从而诱导上皮细胞向间质细胞转变，但阻断TGFβ信号传导会可提高单抗的抗肿瘤作用[18]。

3.2 放疗抗性模型

FLO-1R、SKGT-4R、OE33R是食管细胞接受放疗后产生抗性的食管腺癌细胞系亚型。细胞周期蛋白依赖性激酶9(CDK9)在细胞内转录水平上调控辐射诱导组织损伤的几个核心蛋白和细胞途径。BAY1143572是高特异性CDK9抑制剂，对食管腺癌的放射具有增敏作用。作为CDK9抑制的候选靶点，Axl在FLO-1和SKGT4细胞中的过表达会增强CDK9抑制剂的放射增敏性，CDK9抑制剂会提高OE33R食管腺癌对放射抗性的敏感作用。BAY1143572以 CDK9为靶点可显著增强放疗效应[19]。

OE33 Cis R腺癌细胞对放疗产生抗性。食管腺癌是一种由炎性反应驱动的癌症,OE33 Cis R细胞分泌的蛋白水平显著改变。OE33 Cis R细胞ALDH1活性增加，转化生长因子β信号、Wnt信号和类固醇生物合成显著上调。Cisplatin抗性导致炎性反应因子IL-7分泌的水平增加，且耗氧率显著升高。获得性顺铂耐药的同基因OAC模型的分子和表型变化为这项研究提供了新的见解，并突出了肿瘤细胞内顺铂耐药的治疗靶点[20]。

4 食管腺癌异种移植模型

食管腺癌异种移植模型分为原位移植模型、皮下移植模型和PDX模型(表3)。

表3 食管腺癌异种移植物模型Table 3 Xenograft models of esophageal adenocarcinoma

4.1 原位移植模型

食管腺癌原位移植模型是将食管腺癌手术标本或活检组织植入免疫缺陷的小鼠食管内[21]，构建相似的肿瘤生长环境而建立的模型。原位移植模型能够更好的反应肿瘤的细胞生物学特点，有利于研究肿瘤细胞的侵袭性和异质性。由于实验复杂和移植难度大，食管腺癌的原位移植在科学研究中很少应用，更多被认为是一种理论模型。

4.2 皮下移植模型

食管腺癌皮下移植模型是将食管腺癌细胞移植入NOD-SCID小鼠皮下而构建移植模型。皮下移植模型能够反应肿瘤细胞的异质性，是研究食管腺癌细胞增殖和侵袭的有力工具。虽然不能对肿瘤细胞进行多层次的研究，但皮下移植模型有助于分析食管腺癌细胞的增殖和代谢的机制。

OE33细胞接种NOD-SCID小鼠皮下成瘤。食管腺癌细胞内TGFβ和JNK信号通路过度激活，肿瘤组织磷酸化JUN和SMAD蛋白的核定位增强，受其调控的基因在EAC过度表达。通过移植模型中SMAD4的独立方式，药物抑制或敲除FLO-1或EsoAd1中的TGFβ或JNK信号成分，可以显著降低小鼠的肿瘤细胞增殖、集落形成、细胞迁移或异种肿瘤的生长。阻断TGFβ和JNK信号通路可能是治疗EAC的策略[22]。其对于肿瘤的治疗研究和探索提供了不同的途径。

4.3 PDX模型

食管腺癌PDX模型是从患者的食管腺癌组织中分离出腺癌细胞，接种在NOD-SCID小鼠皮下成瘤所构建的模型。PDX模型可以用于临床研究和药物实验，有助于了解食管腺癌细胞的生理病理学特点。相比于其他移植模型，用于研究的食管腺癌细胞直接来源于患者，研究肿瘤样品易获取，保留了肿瘤细胞原有的性质和特点。获取的肿瘤细胞存在细胞分化差异，PDX模型的肿瘤细胞更易呈现异质性，为肿瘤研究提供了有力的研究材料。

食管腺癌细胞接种在NOD-SCID小鼠皮下构建PDX模型，用于评价治疗肿瘤细胞的疗效。精确照射会显著延缓PDX模型的异种移植瘤生长，联合放化疗会进一步延缓生长。照射后，PDX模型显示Hh转录的持续调节。5E1是一种单克隆SHH抗体，LDE225是一种抑制Hh(Hedgehog)信号通路的临床SMO抑制剂。LDE225、辐射及单独使用5E1的Hh反应性PDX模型中，单独使用任何一种治疗，都可延迟生长，但非反应性PDX模型中没有呈现。表明，Hh信号传导介导了EAC-PDX模型中的辐射反应，抑制该信号通路可能增强Hh依赖性肿瘤的辐射效应[23]。

食管腺癌细胞PDX模型为抗血管生成药物的联合化疗提供了治疗肿瘤的重要策略。PDX模型可以阐述血管内皮生长因子受体2(vascular end-othelial growth factor receptor 2，VEGFR2)针对腺癌血流动力学及药物渗透的影响。长期抗VEGFR2治疗的肿瘤会造成导致化疗摄取减少的相对较低的流量和血管密度，短期的VEGFR2靶向治疗则相反。短期抗血管生成治疗通过诱导一氧化氮的合成和透明质酸的降解彻底重塑肿瘤基质，从而扩张血管，改善肿瘤内化疗的传递。所确定的有针对性的机制，提高了直接选择的抗血管生成治疗联合化疗治疗EAC的疗效[24]。

5 3D培养

3D培养是通过微环境影响对细胞的功能和反应特点进行研究的平台，对肿瘤细胞的研究和探索具有推动作用。肿瘤细胞具有很强的分化和克隆能力，往往会因细胞基因表达错误和缺失而形成异质性。肿瘤细胞的异质性给临床研究和治疗带来了巨大的困难和挑战。肿瘤细胞的增殖分化、凋亡转移受到微环境变化的影响。因此，肿瘤的3D培养可以更好的研究和观察肿瘤细胞生物学变化。3D类器官培养能够复述细胞的特点和特征，对肿瘤研究具有重要作用。

类器官3D培养在肿瘤研究中得到越来越多的应用，为探索肿瘤细胞的性质及对微观环境变化的影响提供了有力的工具。类器官培养能够提供肿瘤细胞更接近增殖的体外环境，能够更加容易调节和干涉肿瘤细胞增殖的微观因素，便以观察肿瘤的细胞生物学特点和恶变机制。类器官3D培养可以研究肿瘤细胞的分子水平的调节和表达异常，有助于深入研究肿瘤细胞多重因素间的作用靶点。此外，食管腺癌细胞内的分子表达异常会影响肿瘤的增殖和转移。shRNA介导的MKK6基因敲除抑制类器官模型内OE33 和 OE19细胞增殖，MKK6抑制会导致转录因子SOX9水平降低。敲除CRISPR/Cas9和SOX9基因会导致EACs在3D器官培养中的增殖下降，肿瘤生长速度减慢。食管腺癌细胞内的分子表达异常会影响肿瘤的增殖分化[25]。

6 结论

食管腺癌移植模型对细胞功能和特点提供了一个不同的探索方式。肿瘤微环境能够影响肿瘤细胞的信息传导和信号途径的激活，甚至可以引发肿瘤的恶性克隆和远处转移。肿瘤细胞的基因突变和mRNA分子表达异常会导致异质性和对放化疗微环境的适应性。异种移植模型能够研究食管腺癌细胞的生理病理学特点和肿瘤细胞异质性，但很少涉及多重因素和复杂微环境的相互作用。3D类器官培养能够反应食管腺癌细胞的异质性和形态变化，有助于研究和探索肿瘤细胞微观水平表达的问题，推动食管腺癌研究不断向前迈进。