玉米氨基酸测定中缓冲溶液国产化研究

陈 超 姜 涛 胡建蓉

(中储粮成都储藏研究院有限公司，成都 610031)

谷物是膳食蛋白质的主要来源之一，其提供的氨基酸对人体生长及新陈代谢起着重要作用。生物对蛋白质的需求本质上是对氨基酸的需求[1]。氨基酸可提高膳食蛋白中微量元素的生物有效性[2]；赖氨酸可促进脂肪酸被人体正常利用[3]；苏氨酸可防止脂肪在肝脏堆积[4]。

随着人们健康意识的日益增强，日常主食的营养功能引起人们高度关注，谷物的营养品质越来越受到重视，谷物中氨基酸含量和组成，是决定其营养品质和食味品质优劣的重要指标。孟强等[5]利用邻苯二甲醛(OPA)柱前衍生反相高效液相色谱法(RP-HPLC)测定了60份糯玉米自交系中游离氨基酸的组成及含量来筛选优良的糯玉米品种；刘慧等[6]利用直接水解法等方法测定了655份小麦中18种氨基酸含量，评价不同地区小麦的营养品质；叶霞等[7]通过测定赖氨酸和色氨酸含量变化来研究稻米的陈化过程。因此，氨基酸的快速检测方法成为谷物育种、营养评价及储藏研究的关键技术。

氨基酸自动分析仪因其效率高被广泛用于氨基酸测定，本研究利用LA8080氨基酸自动分析仪对18个玉米中氨基酸含量进行测定。开发一种氨基酸快速测定方法，以期对后期谷物育种、营养评价及储藏提供参考。同时，进行试剂国产化研究以降低检测成本。

1 材料与方法

1.1 实验材料

18个自然风干的玉米样品,市售。分别选取灌浆良好且无病虫害的玉米籽粒，粉碎，全部通过0.25 mm标准筛，用“四分法”选取检测样品。

1.2 主要试剂

H型混合氨基酸标液、R1、R2、PH-1、PH-2、PH-3、PH-4、PH-RG，均为原装进口试剂。

柠檬酸钠(二水)、氢氧化钠、氯化钠、柠檬酸(一水)、乙醇、苯甲醇、BJ-35、辛酸、乙二醇甲醚、茚三酮、硼氢化钠、醋酸钠、醋酸，以上试剂均为国产分析纯或优级纯；实验用水均为超纯水。

1.3 仪器与设备

LA8080高速氨基酸分析仪；ED115型烘箱；FSJ-Ⅱ锤片式旋风磨；XS105型电子天平；Milli-Q超纯水制备系统。

1.4 样品前处理及氨基酸检测

1.4.1 样品制备

称取过筛后充分混匀的玉米样品2～10 g，放入已烘干至恒重的铝制扁形称量瓶中，置于101～105 ℃的烘箱中24 h后，取出盖好，置于干燥器内冷却30 min，称量；称量后再复烘1 h，冷却30 min，称量，重复至前后质量相差低于2 mg，并计算制备样品水分，玉米水分计算参照GB 5009.3—2016《食品安全国家标准 食品中水分的测定》进行。

1.4.2 样品酸水解

样品酸水解方法参照GB 5009.124—2016《食品安全国家标准 食品中氨基酸的测定》进行。前处理后的样品，过0.22 μm的滤膜待测。

1.4.3 氨基酸测定

利用LA8080高速氨基酸分析仪测定样品中17种氨基酸，玉米中氨基酸的计算参照GB 5009.124—2016《食品安全国家标准 食品中氨基酸的测定》。

1.5 数据统计与分析

实验数据的统计使用 Office Excel 2010软件。

2 结果与分析

2.1 仪器分析性能测试

2.1.1 分离度

根据现行国家计量检定规程JJG 1064—2011《氨基酸分析仪》相应技术要求，通过测试苏氨酸(Thr)～丝氨酸(Ser)、甘氨酸(Gly)～丙氨酸(Ala)、异亮氨酸(Ila)～亮氨酸(Lea)的分离度，实验使用原装试剂(缓冲液和茚三酮)和氨基酸混合标准溶液进行，做6次平行实验，结果见表1。3组氨基酸分离度均满足相关要求，各组分离度标准偏差均为0.01，说明仪器性能较稳定。

表1 分离度测试结果

2.1.2 峰面积和峰保留时间重复性

对于峰面积和峰保留时间重复性的测试与分离度测试同时进行，做6次平行实验，结果见表2。峰面积和峰保留时间重复性均满足要求，其中丙氨酸峰保留时间变异系数为0，重复性较好。采用原装进口试剂，该氨基酸分析仪测试性能符合相关性能保证指标要求。色谱图见图1。由于原装进口试剂成本较高，所以有必要开发国产试剂配方，以降低检测成本。

表2 峰面积和峰保留时间重复性测试结果

图1 原装试剂标准色谱图

2.2 试剂国产化研究

2.2.1 缓冲液及茚三酮配方国产化

缓冲液pH、钠离子浓度的变化会影响峰保留时间和峰分离度，从而影响氨基酸分离的准确性。用国产试剂按《LA8080高速氨基酸分析仪使用说明书》配方配制出来的缓冲液可能会与进口试剂pH值、钠离子浓度存在差异，导致峰位移甚至变形，影响分离效果。高翠红等[8]发现按照厂家原配方配制的PH-1缓冲液酸碱度偏酸，需添加6～7 mL的1 mol/L的氢氧化钠才能符合实验要求。2019月1月逐一进行了PH-1、PH-2、PH-3、PH-4、PH-RG及茚三酮缓冲液配方国产化研究实验，通过调整缓冲液钠离子浓度、pH，最终得到国产化缓冲液配方，见表3。本配方比原配方PH-1缓冲液中柠檬酸钠的含量多1 g；原配方中硫代双乙醇属于剧毒品，其与盐酸反应会生成芥子气。本配方用无毒害的乙醇代替硫代双乙醇；茚三酮反应液配方参考王华等[9]开发的配方,用乙二醇甲醚代替二丙二醇单甲醚，醋酸钠代替醋酸锂，实验证明本配方配制的缓冲液及茚三酮反应液，分离效果和基线均满足实验要求。色谱图见图2。结果表明，本配方所得缓冲液实验结果显示基线稳定、灵敏度高、分离效果好，可替代原装进口试剂。

表3 缓冲液及茚三酮配制试剂国产化配方

图2 国产试剂标准色谱图

2.2.2 国产试剂配方仪器性能测试

使用国产试剂配制缓冲液及茚三酮溶液，对仪器分离度、峰面积和峰保留时间重复性进行测试，结果见表4和表5。采用国产试剂，该氨基酸分析仪测试性能符合相关性能保证指标要求。实验空白见图3，空白实验基线整体较平稳，由于国产试剂杂质较多，为保证仪器正常、稳定运转，各缓冲液配制后须通过0.2 μm滤膜备用。

表4 国产试剂分离度测试结果

表5 国产试剂峰面积和峰保留时间重复性测试结果

图3 国产试剂空白色谱图

2.2.3 国产试剂配方方法的线性关系、回收率及精密度实验

将H型混合氨基酸标液(2.5 μmol/mL)分别稀释成浓度为10、20、40、80、100 μmol/L的混合氨基酸工作液。以各氨基酸的浓度为横坐标，氨基酸峰面积为纵坐标进行线性回归分析得到线性回归方程。

准确称取已知氨基酸含量的玉米样品6份，前处理后，分别加入一定量的氨基酸标准液，计算其回收率和变异系数,结果见表6。

表6 国产试剂配方方法的线性关系、回收率及精密度结果

表7 玉米中氨基酸质量分数/%(以干基计)

各氨基酸相关系数在0.999 2～0.999 8之间，线性关系良好；各氨基酸的回收率在99.96%～101.42%之间，变异系数范围为0.57%～0.86%。说明国产试剂配方方法准确度和精密度较高，实验结果可靠。

2.3 玉米中氨基酸含量

利用LA8080高速氨基酸分析仪测定玉米中氨基酸种类及其含量，结果见表7，玉米样品色谱图见图4。所测氨基酸均以干基计，谷氨酸是玉米中含量最丰富的氨基酸，玉米中含量最少的氨基酸为胱氨酸，赖氨酸质量分数为0.31%～0.38%。

图4 玉米氨基酸色谱图

脯氨酸与茚三酮反应生成黄色物质，在440 nm处吸收峰最大。同其他氨基酸与茚三酮反应生成蓝色物质不同，所以在前10 min出现峰重叠的情况为双通道同时检测。

2.4 缓冲液成本与社会效益分析

自配缓冲液方法简单，且符合实验要求。因国产试剂价格较低，配制一套与原装进口试剂数量一样的试剂，成本较原装进口试剂降低了88%。以饲料氨基酸检测为例，2018年全国饲料总产量18 131.58万t，2019年前三季度全国饲料总产量19 317.2万t。若每500 t抽取一个检验样品，每个样品检验成本降低5元，将节省约300余万元检验成本。目前，国内不同领域氨基酸检测需求大，较低的试剂成本将带来较大的经济效益。本配方用无毒害的乙醇代替硫代双乙醇，规避了实验人员操作风险，降低了废液处理成本，减轻了对环境的污染。

3 结论

本研究利用性能稳定的LA8080高速氨基酸分析仪及国产化试剂测定了玉米中17种氨基酸含量，结果表明，玉米中含量最多和最少的氨基酸，分别为谷氨酸和胱氨酸。国产化试剂对仪器性能测试说明检测结果是高效可靠的，各氨基酸回收率范围为99.96%～101.42%，同时，与进口试剂相比国产试剂成本降低了88%。说明此方法重现性好，且节约成本，是一种低成本快速测定氨基酸的理想方法。为后期大量氨基酸方面的研究提供了参考。