柑橘果醋发酵条件的优化及其成分分析

杨馨悦，杨宇驰，周秀娟，薛桂新*

(1.延边大学 农学院，吉林 延吉 133002；2.吉林省产品质量监督检验院，长春 130012)

柑橘常温贮藏期较短，季节性收获时易造成大量堆积腐烂现象，影响果农的经济收入以及当地的经济发展。柑橘含汁量较高，适合加工成饮料、果酒和果醋等液体产品。柑橘适合加工成饮料，但产品单一，可以加工成果酒和果醋，但柑橘中含柠檬苦素等会导致果酒味苦，若先加工成果酒再加工成果醋，在醋酸发酵过程中柠檬苦素等会逐渐减少或消失，果醋品质较好。因此，将柑橘加工成果醋既能增加农民收入，缓解滞销，降低损失，又能增加果醋新品种，提高附加值，这对提高柑橘的综合利用、推动果醋的产业化发展都具有重要意义。

近些年来，国内外学者对葡萄、苹果、桑葚、火龙果、山枣果醋及其果醋饮料进行了研究，但对柑橘果醋的研究较少[1-10]，对柑橘果醋发酵基质优化条件及其主要成分的分析报道较少[11-13]。

本试验采用液态表面发酵法对柑橘果醋发酵基质中的酒精度、营养盐、底酸和发酵温度进行正交优化试验，并对优化后柑橘果醋的主要成分进行了分析，为柑橘果醋的酿造技术和品质的研究提供了参考。

1 材料与方法

1.1 材料

柑橘：市售；白砂糖：GB 317-2006，广东大华糖业有限公司生产；酵母菌：富门伯恩酵母(Fermol Rouge Bayanus)，品种为Saccharomycescerevisiaeph. v. bayanus，购自意大利AEB公司；果胶酶：德国三颗星食品物料公司；醋酸菌：沪酿1.01号醋酸菌种，上海酿造科学研究所。

1.2 试剂与药品

酵母浸膏(BR)、葡萄糖(AR)、氢氧化钠(AR)、酚酞指示剂(AR)、亚硝酸钠(AR)、硝酸铝(AR)、乙醇(AR)、营养盐(食品级)：湖北省宜昌市安琪酵母股份有限公司。

磷酸、甲醇、乙腈、乙酸乙酯：色谱纯；DL-酒石酸、L-苹果酸、柠檬酸、L-乳酸、没食子酸、(+)-儿茶素、表儿茶素、咖啡酸、绿原酸、阿魏酸、对香豆酸、芦丁、白藜芦醇、槲皮素：以上标准品均购自上海源叶生物科技有限公司。

1.3 主要仪器与设备

HH.S型电热恒温水浴锅 江苏省医疗机械厂；HH-B11-600型电热恒温培养箱 天津市津北真空仪器厂；YH01L310型立式压力蒸汽锅 上海医用核子仪器厂；BSA124S-CW型电子天平 赛多利斯科学仪器有限公司；SW-CJ型净化工作台 上海新苗医疗器械制造有限公司；UV-7504型紫外分光光度计 欣茂仪器有限公司；TDZ5-WS型高速离心机 湖南湘仪实验室仪器开发有限公司；LC-2010A型高效液相色谱仪 日本岛津公司。

1.4 柑橘果醋工艺流程及操作要点

1.4.1 工艺流程

柑橘→去皮→打浆→调整糖度→加入活化酵母菌↓酒精发酵→醋酸菌种子液培养↓柑橘果醋发酵基质配制→醋酸发酵→柑橘果醋→杀菌→常温贮存。

1.4.2 酒精发酵

柑橘去皮打浆，加入适量果胶酶，混匀。待酶解完成后，调整果浆糖度，取柑橘重量0.02%的酵母，活化后加入柑橘果浆内搅拌均匀。在25 ℃左右室温下发酵，当酒精度为12%左右时，发酵结束，滤出酒液备用。

1.4.3 醋酸菌种子液制备

取1%酵母浸膏、1%葡萄糖放入1000 mL三角瓶中，经121 ℃灭菌20 min，取出冷却。再加入4%的食用酒精混匀，在无菌室内用接种环挑取斜面醋酸菌接种于液体培养基中，摇匀放入30 ℃恒温培养箱中培养，当总酸含量为2%左右时，即可作为种子液使用。

1.4.4 柑橘果醋发酵基质配制

柑橘果醋发酵基质由柑橘果酒、底酸、营养盐和醋酸菌种子液组成，按照单因素试验设计和正交试验设计进行配制，发酵基质占容器体积的10%。

1.5 柑橘果醋发酵工艺单因素试验

采用柑橘果醋发酵工艺，分别对酒精度(5%、6%、7%、8%)、营养盐含量(0.00%、0.05%、0.10%、0.15%)、底酸含量(0.6%、0.8%、1.0%、1.2%、1.4%)和发酵温度(30，32，34 ℃)做单因素试验，以柑橘果醋总酸含量为主要考察指标，酒精转化率和发酵时间为参考指标。

1.6 柑橘果醋发酵工艺正交优化试验

根据单因素试验结果，酒精度为6%，对营养盐含量、底酸含量和发酵温度进行三因素三水平正交试验。试验按L9(34)正交表设计，见表1。

表1 柑橘果醋发酵条件优化正交设计Table 1 Orthogonal design optimization of fermentation conditions for citrus fruit vinegar

1.7 柑橘果醋总酸含量的分析

参照GB/T 12456-2008《食品中总酸的测定》，以乙酸计[14]。

1.8 柑橘果醋的成分分析

以柑橘果汁为参比，对柑橘果醋中的主要成分进行分析。

1.8.1 总黄酮的分析

根据王晓林等[15]的方法，略有改动。样品处理：取杀菌冷却后的柑橘果醋于3000 r/min离心10 min后备用。

取样液1 mL，加入0.5 mL 5%亚硝酸钠摇匀，放置6 min。加入0.5 mL 10%硝酸铝摇匀，放置6 min，加入5 mL 4%氢氧化钠，以60%乙醇定容至10 mL，摇匀，放置15 min，以3500 r/min离心10 min，取上清液倒入比色皿中，以蒸馏水为参比，在509 nm下测定吸光度。利用标准曲线计算总黄酮含量。

1.8.2 有机酸的分析

参考GB 5009.157-2016《食品有机酸的测定》[16]，略有改动。样品处理与1.8.1一致。取样液用流动相稀释一定倍数后，过0.45 μm滤膜后进样分析。

色谱条件：采用C18柱，流动相为0.1%磷酸水溶液∶甲醇为97.5∶2.5(V/V)，紫外检测波长210 nm；柱温40 ℃；流速0.8 mL/min；进样量20 μL。

1.8.3 总酚的分析

总酚采用福林酚法分析[17]，以没食子酸作为标准品进行定量，利用标准曲线计算总酚含量。

1.8.4 单体酚的分析

参照孙翔宇等[18]的方法，略有改动。样品处理与1.8.1一致。取样液10 mL，以2倍体积(20 mL)的乙酸乙酯萃取3次，合并有机相，在35 ℃下减压浓缩至干，以5 mL甲醇复溶，过0.45 μm滤膜后进样分析。

色谱条件：采用 C18柱；流速0.8 mL/min；进样量20 L，柱温30 ℃；采用二元梯度洗脱；流动相A：乙腈-冰乙酸(98∶2，V/V)，流动相 B：水-冰乙酸(98∶2，V/V)。梯度洗脱程序见表2。

表2 梯度洗脱程序Table 2 The gradient elution procedure

续 表

2 结果与分析

2.1 柑橘果醋发酵工艺单因素试验

2.1.1 不同酒精度对醋酸发酵的影响

图1 不同酒精度对柑橘果醋发酵的影响Fig.1 The effect of different alcohol content on fermentation of citrus fruit vinegar

由图1可知，发酵基质中酒精度不同，总酸含量、酒精转化率均不同。随着酒精度的增加，最高总酸含量分别达到5.037%、5.971%、6.464%、6.474%，且酒精度为7%和8%与其他两组均具有显著性差异(P<0.05)，这是因为酒精是醋酸发酵的底物，在一定范围内底物充足，醋酸含量高。但酒精转化率却随着酒精度增加而降低，当酒精度为5%、6%、7%、8%时，其酒精转化率分别为97.01%、95.70%、88.68%、77.26%，均存在显著性差异(P<0.05)。本试验以酿制一级醋(醋酸含量>5%)为目标，因此，从实际生产等综合因素方面考虑，选择醋酸发酵的酒精度为6%。

2.1.2 不同营养盐含量对醋酸发酵的影响

营养盐中含有醋酸菌生长所必需的盐类及生长因子，具有强化醋酸菌生长与代谢的作用，能有效地缩短发酵周期，提高醋酸产量，改善醋酸品质及降低生产综合成本[19]。

图2 不同营养盐含量对柑橘果醋发酵的影响Fig.2 The effect of different nutritive salt content on fermentation of citrus fruit vinegar

由图2可知，当营养盐含量为0.10%和0.15%时，柑橘果醋总酸含量无显著性差异，但均显著高于对照组和0.05%的处理组。当营养盐含量为0.10%和0.15%时，其酒精转化率为94.72%和94.32%，不存在显著性差异(P>0.05)；而对照组和0.05%处理组的酒精转化率仅能达到88.42%和91.69%。因此，从生产成本等综合因素方面考虑，选择营养盐0.10%为最佳含量。

2.1.3 不同底酸含量对醋酸发酵的影响

图3 不同底酸含量对柑橘果醋发酵的影响Fig.3 The effect of different base acid content on fermentation of citrus fruit vinegar

由图3可知，当底酸含量分别为0.6%0.8%、1.0%、1.2%时，柑橘果醋总酸最高含量无显著差异，但均显著高于1.4%时。在底酸含量分别为0.6%、0.8%、1.0%、1.2%时，柑橘果醋的酒精转化率分别达到93.11%、93.11%、95.13%、92.09%，显著高于(P<0.05)底酸含量1.4%时的酒精转化率88.25%。由此说明，柑橘果醋发酵基质中的底酸含量不宜超过1.2%。

2.1.4 不同发酵温度对醋酸含量的影响

图4 不同发酵温度对柑橘果醋发酵的影响Fig.4 The effect of different fermentation temperatures on fermentation of citrus fruit vinegar

由图4可知，当发酵温度为30，32，34 ℃时，3个发酵温度最大总酸含量之间无显著性差异，其酒精转化率分别为95.21%、92.33%、95.61%，也不存在显著性差异(P>0.05)。因此，在温度变化范围较小的情况下，对柑橘果醋的总酸含量和酒精转化率影响较小。

2.2 柑橘果醋发酵条件正交试验结果与分析

表3 柑橘果醋正交试验结果Table 3 Orthogonal test results of citrus fruit vinegar

由表3可知，5号试验柑橘果醋总酸含量最高，为6.167%；酒精转化率最高，为98.83%；发酵时间为84 h，即当营养盐含量为0.10%、底酸含量为0.8%、发酵温度为34 ℃的条件下柑橘果醋最佳优化组合为A2B2C3。但分析结果最佳优化组合为A2B2C2，分析结果与试验结果不同，进行验证试验，试验结果见表4。

表4 验证试验结果Table 4 Verification test results

分析验证试验结果，组合A2B2C3的总酸含量和酒精转化率均高于组合A2B2C2，且发酵时间较组合A2B2C2短12 h。因此，组合A2B2C3为最佳优化组合，即营养盐含量为0.10%，底酸含量为0.8%，发酵温度为34 ℃时总酸含量为6.167%。

通过极差分析可以看出，RA>RC>RB，说明营养盐含量对柑橘果醋总酸含量影响最大(RA=0.261)，底酸含量对柑橘果醋总酸含量影响最小。发酵温度介于营养盐含量和底酸含量之间。

表5 柑橘果醋总酸含量正交试验方差分析表 Table 5 Variance analysis table of orthogonal test for total acid content of citrus fruit vinegar

对表3试验结果进行方差分析得出表5，营养盐、底酸和发酵温度的P值均为0.000(P<0.01)，说明3个因素对柑橘果醋总酸含量的影响均为极显著。

2.3 柑橘果醋的主要成分分析

2.3.1 总黄酮含量的分析

图5 柑橘果醋中的总黄酮含量Fig.5 The content of total flavonoids in citrus fruit vinegar

由图5可知，柑橘果汁、果醋中的总黄酮含量分别为224.09，85.45 mg/L，果醋中的总黄酮含量显著低于柑橘汁中的总黄酮含量，这可能是由于柑橘果醋的醋酸发酵时间长、需氧发酵等使总黄酮含量损失的结果[20]。

2.3.2 有机酸含量的分析

图6 柑橘果醋中的有机酸含量Fig.6 The content of organic acids in citrus fruit vinegar

由图6可知，柑橘果醋和柑橘汁中不同种类有机酸的含量均具有显著性差异(P<0.05)。其中，柑橘汁中的有机酸含量：柠檬酸>苹果酸>酒石酸和乳酸。酒石酸和乳酸含量无显著性差异(P>0.05)。柑橘果醋中的有机酸含量：乳酸>柠檬酸>苹果酸>酒石酸，其中乳酸含量远高于其他3种有机酸，其他3种有机酸均具有显著性差异(P<0.05)。

有学者研究表明，醋酸菌在果醋发酵过程中，代谢消耗苹果酸、柠檬酸而产生和积累乳酸[21]，产生的乳酸可以缓冲乙酸的强烈刺激性。同时，醋酸菌发酵过程中苹果酸和柠檬酸的降低，会减少尖酸刺激感和增加醋的澄清度。

2.3.3 总酚含量的分析

图7 柑橘果醋中的总酚含量Fig.7 The content of total phenols in citrus fruit vinegar

由图7可知，柑橘果醋中的总酚含量显著低于柑橘汁中(P<0.05)，这是因为醋酸菌属于需氧性微生物，在整个醋酸发酵过程中需提供足够的氧气，发酵液中酚类物质被破坏，导致其含量降低[22]。

2.3.4 单体酚含量的分析

图8 柑橘果醋中的单体酚含量Fig.8 The content of monomeric phenols in citrus fruit vinegar

由图8可知，柑橘果醋中，槲皮素、表儿茶素、儿茶素、绿原酸含量相对较高，其他酚类物质含量较低。柑橘汁中10种单体酚的含量存在显著性差异，槲皮素、表儿茶素、儿茶素和阿魏酸的含量相对较高，其他酚类物质含量较低。同一种单体酚在柑橘汁和柑橘醋中含量各不相同。

3 结论

采用液态表面发酵法发酵的柑橘果醋在酒精度为6%的条件下，营养盐含量0.10%，底酸含量0.8%，发酵温度34 ℃为醋酸发酵最佳组合，在此条件下酿制的柑橘果醋总酸含量可达到6.167%。

柑橘果醋在检测的4种有机酸中，乳酸含量远高于柠檬酸、苹果酸、酒石酸；在检测的10种单体酚中，槲皮素、表儿茶素、儿茶素含量高于其他单体酚；柑橘果醋总酚和总黄酮含量均低于柑橘果汁。