通过SIRT1信号通路探究涤痰止晕方对缺血性眩晕大鼠脑组织作用的影响*

唐山市丰润区中医医院

赵元奎 安志红△ 周淑红△ 王久敏△ 李春蕾△(唐山 064000)

提要 目的：研究分析涤痰止晕方通过沉默信息调节因子1(SIRT1)信号通路对缺血性眩晕大鼠脑组织的影响。方法：选SPF级健康雄性SD大鼠60只，随机分为假手术组10只和造模组50只。造模组采用右颈总动脉和右锁骨下动脉结扎法建立缺血性眩晕模型，假手术组大鼠接受假手术。将造模成功的大鼠随机分为模型组、盐酸地芬尼多组及涤痰止晕方低、中、高浓度组，各10只。模型组、假手术组分别给予生理盐水 5 mL/kg，每日1次，灌胃给药；盐酸地芬尼多组给予3 mg/mL盐酸地芬尼多溶液 5 mL/kg，每日1次，灌胃给药；涤痰止晕方低、中、高浓度组分别给予生药浓度为0.2、0.4、0.8 g/mL的涤痰止晕方5 mL/kg，每日1次，灌胃给药。各组大鼠均给药1周。检测比较各组逃避电击潜伏期、脑组织能量代谢及氧化应激指标水平，以及脑组织SIRT1、过氧化物酶体增殖物受体γ共激活因子1α(PGC-1α)、磷酸化叉头框蛋白O3α(p-FOXO3α)表达水平。结果：与模型组比较，各组大鼠逃避电击潜伏期较短，脑组织乳酸(Lac)、乳酸脱氢酶(LDH)水平较低，脑组织丙二醛(MDA)水平较低，且涤痰止晕方低浓度组>涤痰止晕方中浓度组>涤痰止晕方高浓度组和盐酸地芬尼多组，差异均有显著性(均P<0.05)。与模型组比较，各组大鼠脑组织超氧化物歧化酶(SOD)水平较高，脑组织SIRT1、PGC-1α、p-FOXO3α表达水平较高，且涤痰止晕方低浓度组<涤痰止晕方中浓度组<涤痰止晕方高浓度组和盐酸地芬尼多组，差异有显著性(P<0.05)。结论：涤痰止晕方能剂量依赖性的缩短缺血性眩晕大鼠逃避电击潜伏期，改善脑组织能量代谢，抑制氧化应激反应，其作用可能与上调SIRT1信号通路活性有关。

缺血性眩晕是由于前庭神经和感受器、及相关中枢神经缺血引起的空间定向障碍、平衡功能紊乱所导致的运动性幻觉，以突然发生的自身或(和)外界物体旋转感、浮沉感、摇摆感、漂移感等为主要表现。[1]眩晕为临床常见病之一，据统计，在成年人群中该病发病率高达20%～30%，[2]其主要包括周围性眩晕和中枢性眩晕两大类，其中包括缺血性眩晕在内的中枢性眩晕约占10.1%～11.0%。[2]缺血性眩晕常继发于椎-基底动脉供血不足、脑梗死等缺血性脑血管病，一般伴有恶心呕吐、出汗、平衡失调、站立不稳、倾倒、眼震等症状，对患者的日常生活造成严重影响。目前，西医主要采用抗眩晕剂、镇静剂、脱水药、改善循环药物等对缺血性眩晕进行治疗[4]，能够在一定程度上缓解眩晕症状，但无法有效减少眩晕的发生，治疗效果并不理想。中医药在眩晕的治疗中有悠久的历史和丰富的经验，已经有研究证实[5]，中医药治疗缺血性眩晕的临床效果较好，但相应的实验研究较少。本次研究就是主要探讨中药复方涤痰止晕方通过沉默信息调节因子1(SIRT1)信号通路对缺血性眩晕大鼠脑组织的影响，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 材料

1.1.1 研究对象：60只7～8周龄SPF级健康雄性SD大鼠，购自天津市中医药大学第一附属医院，动物许可证号：SCXK(津)2015-0003，体质量280～300 g。所有大鼠置于动物房内饲养，每个鼠笼5只，室内环境设定为温度22～24℃，相对湿度45%～55%，噪音低于50 dB，照明时间7：00～19：00，通风良好，饲以充足的普通标准饲料和蒸馏水，大鼠自由进食和饮水，定期清扫鼠笼、消毒。

1.1.2 主要药品与试剂：涤痰止晕方(组成：白术、陈皮各10 g，天麻12 g，薏苡仁15 g，石菖蒲、半夏、川芎各 12 g，赤芍15 g)，药物购自天津中医药大学第一附属医院，使用时加水浸泡30 min，煎煮2次，浓缩为生药浓度为0.2、0.4、0.8 g/mL的涤痰止晕方药液，置于-20℃冰箱保存备用。盐酸地芬尼多片，规格：每片25 mg，国药准字H51022154，批号：20180130，购自地奥集团成都药业股份有限公司，使用时用蒸馏水制备成浓度为3 mg/mL的盐酸地芬尼多，现用现配；注射用青霉素钠，规格：每支80万单位，国药准字H41020094，批号：20180207，购自天津药业焦作有限公司。10%水合氯醛，购自武汉远城科技发展有限公司；乳酸(Lac)、乳酸脱氢酶(LDH)、超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)酶联免疫分析(ELISA)法检测试剂盒，购自南京金益柏生物科技有限公司；磷酸盐缓冲液(PBS)溶液、TBST缓冲液，购自孟成科技(上海)有限公司；细胞裂解液，购自上海浩然生物技术有限公司；二喹啉甲酸(BCA)蛋白定量试剂盒，购自北京嘉美纽诺生物科技有限公司；十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)凝胶配制试剂盒，购自北京纽朴生物技术有限公司；兔抗鼠SIRT1、过氧化物酶体增殖物受体γ共激活因子1α(PGC-1α)、磷酸化叉头框蛋白O3α(p-FOXO3α)、肌动蛋白(β-actin)单克隆抗体，购自上海邦奕生物科技有限公司；辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG，购自合肥博美生物科技有限责任公司；氧化二氨基联苯胺(DAB)辣根过氧化物酶显色试剂盒，购自上海信裕生物科技有限公司；ECL超敏发光液，上海勤翔科学仪器有限公司。

1.1.3 主要仪器设备：TD-420型台式低速离心机，四川蜀科仪器有限公司产品；yls-3tb型跳台记录仪，安徽正华生物仪器设备有限公司产品；BEPTMⅢ型酶联免疫分析系统，德国Siemens公司产品；Invitrogen iBright型凝胶成像系统，美国Thermo Fisher Scientific公司产品。

1.2 方法

1.2.1 造模及实验方法[6]：适应性饲养5 d后，将所有大鼠编号并标记，按随机数字表法随机分为造模组50只和假手术组10只。所有大鼠均接受跳台逃避电刺激反射训练，每日2次，连续3 d，训练至大鼠受到电刺激跳上跳台仪平台并保持30 s，建立牢固的逃避电刺激的条件反射；第4 d禁食12 h后腹腔注射10%水合氯醛溶液3.5 mL/kg充分麻醉，采用仰卧位在手术台上固定，颈部常规备皮、消毒，于颈前作纵向切口，逐层切开，寻找并暴露右颈总动脉，造模组进行结扎，之后沿右颈总动脉找到右锁骨下动脉并结扎；假手术组仅暴露右颈总动脉和右锁骨下动脉，不进行结扎；术毕清理伤口，逐层关闭，并采用青霉素溶液涂抹；给予注射用青霉素钠4万单位，每日1次，尾静脉注射，连续给药3 d预防感染。术毕待大鼠清醒后，将其置于离心机内500 r/min旋转30 s骤停，之后立即进行跳台逃避电刺激实验，若大鼠从受到电刺激到跳上跳台仪平台并保持30 s不跌落需要的时间(即逃避电击潜伏期)>150 s，即为成功建立缺血性眩晕模型。按照随机原则及时补齐造模过程中失败或意外死亡的大鼠。

成功建立缺血性眩晕模型的大鼠并随机分为模型组、盐酸地芬尼多组及涤痰止晕方低、中、高浓度组，各10只。术后第2 d开始，模型组、假手术组分别给予生理盐水 5 mL/kg，每日1次，灌胃给药；盐酸地芬尼多组给予3 mg/mL盐酸地芬尼多溶液5 mL/kg，每日1次，灌胃给药；涤痰止晕方低、中、高浓度组分别给予生药浓度为0.2、0.4、0.8 g/mL的涤痰止晕方5 mL/kg，每日1次，灌胃给药。各组大鼠均连续给药1周。

1.2.2 眩晕测试：末次给药后1 h，将大鼠置于离心机内500 r/min旋转，30 s后骤停，之后立即置于yls-3tb型跳台记录仪内，给予30 V、50 Hz电刺激5 min，进行跳台逃避电刺激实验，记录大鼠的逃避电击潜伏期。

1.2.3 标本采集与处理[7]：眩晕测试结束后，将大鼠断头处死，迅速摘取右侧大脑半球，预冷的生理盐水冲去血液后迅速置于冰盘上，取1/2右侧大脑半球，置于含有9倍量生理盐水的匀浆器内，制成10%组织匀浆液，以 3 500 r/min速度离心10 min，获得的组织上清液，保存于-80℃冰箱内；剩余1/2右侧大脑半球经液氮速冻后，保存于-80℃冰箱内以备后续蛋白免疫印迹实验(Western-blot)检测。

1.2.4 ELISA法检测大鼠脑组织能量代谢及氧化应激指标水平[8]：取步骤1.2.3中制备的脑组织上清液，置于4℃冰箱内解冻，按照试剂盒说明书中的操作方式，采用酶免之星TM全自动酶免分析仪，通过ELISA法检测脑组织上清液中能量代谢指标Lac、LDH水平及氧化应激指标SOD、MDA水平。

1.2.5 Western-blot法检测大鼠脑组织SIRT1、PGC-1α、p-FOXO3α表达水平[9]：取1.2.3中冻存的脑组织→采用液氮迅速研磨→PBS冲洗5 min×2次→以3 500 r/min速度离心5 min×2次→加入细胞裂解液150 μL混匀，4℃反应30 min→4℃条件下，以12 000 r/min速度离心2 min，获得总蛋白提取液→BCA蛋白定量试剂盒测定总蛋白含量→SDS-PAGE凝胶配制试剂盒配制分离胶和浓缩胶，灌注于电泳仪上→电泳至溴酚蓝跑出分离胶底部→取目的蛋白所在凝胶，用转移缓冲液平衡4 min→将目的蛋白转印至硝酸纤维素(Nc)膜上→PBS浸洗Nc膜12 min→室温下，用5%脱脂奶粉封闭Nc膜3 h→4℃条件下，用SIRT1、PGC-1α、p-FOXO3α、内参β-actin单克隆抗体工作液(1∶500稀释)孵育16 h→TBST缓冲液冲洗10 min×3次→4℃条件下，用辣根酶标记山羊抗兔IgG工作液(1∶2 000稀释)孵育1 h→TBST缓冲液冲洗5 min×2次→采用DAB辣根过氧化物酶显色试剂盒使目的蛋白显色→在暗室内，采用ECL超敏发光液显影、曝光、定影。

采用凝胶成像系统扫描蛋白条带并拍照，用IPP6.0软件分析各目的蛋白灰度值，计算p-SIRT1、PGC-1α、p-FOXO3α灰度值与内参β-actin灰度值的比值，明确各目的蛋白表达水平。

1.3 统计学分析 所有统计数据均统一整理，采用SPSS22.0软件包分析，符合正态性的计量资料采用均数±标准差表示，多组间比较采用单因素方差分析，P<0.05 为差异存在显著性；组间多重比较采用LSD-t检验，P<0.05 为差异存在显著性。

2 结果

2.1 各组大鼠逃避电击潜伏期情况比较 与假手术组比较，模型组大鼠逃避电击潜伏期延长，差异有显著性(P<0.05)。与模型组比较，涤痰止晕方低、中、高浓度组和盐酸地芬尼多组大鼠逃避电击潜伏期较短，其中涤痰止晕方低浓度组>涤痰止晕方中浓度组>涤痰止晕方高浓度组和盐酸地芬尼多组，差异均有显著性(P<0.05)。详见表1。

表1各组大鼠逃避电击潜伏期比较

2.2 各组大鼠脑组织Lac、LDH水平比较 与假手术组比较，模型组大鼠脑组织Lac、LDH水平升高，差异有显著性(P<0.05)。与模型组比较，涤痰止晕方低、中、高浓度组和盐酸地芬尼多组大鼠脑组织Lac、LDH水平较低，其中涤痰止晕方低浓度组>涤痰止晕方中浓度组>涤痰止晕方高浓度组和盐酸地芬尼多组，差异均有显著性(P<0.05)。详见表2。

表2 各组大鼠脑组织Lac、LDH水平比较

注：与假手术组比较，*P<0.05；与模型组比较，#P<0.05；与低浓度组比较，△P<0.05；与中浓度组比较，◇P<0.05；与高浓度组比较，▲P<0.05。

2.3 各组大鼠脑组织SOD、MDA水平比较 与假手术组比较，模型组大鼠脑组织SOD水平降低，MDA水平升高，差异有显著性(P<0.05)。与模型组比较，涤痰止晕方低、中、高浓度组和盐酸地芬尼多组大鼠脑组织SOD水平较高，其中涤痰止晕方低浓度组<涤痰止晕方中浓度组<涤痰止晕方高浓度组和盐酸地芬尼多组，差异均有显著性(P<0.05)。与模型组比较，涤痰止晕方低、中、高浓度组和盐酸地芬尼多组大鼠脑组织MDA水平较低，其中涤痰止晕方低浓度组>涤痰止晕方中浓度组>涤痰止晕方高浓度组和盐酸地芬尼多组，差异均有显著性(P<0.05)。详见表3。

表3 各组大鼠脑组织SOD、MDA水平比较

2.4 各组大鼠脑组织SIRT1、PGC-1α、p-FOXO3α表达水平比较 与假手术组比较，模型组大鼠脑组织SIRT1、PGC-1α、p-FOXO3α表达水平降低，差异有显著性(P<0.05)。与模型组比较，涤痰止晕方低、中、高浓度组和盐酸地芬尼多组大鼠脑组织SIRT1、PGC-1α、p-FOXO3α表达水平较高，其中涤痰止晕方低浓度组<涤痰止晕方中浓度组<涤痰止晕方高浓度组和盐酸地芬尼多组，差异均有显著性(P<0.05)。详见表4、图1。

表4各组大鼠脑组织SIRT1、PGC-1α、p-FOXO3α表达水平比较

注：A 假手术组；B 模型组；C 低浓度组；D 中浓度组；E 高浓度组； F 盐酸地芬尼多组。图1 Weesterrn-blot法检测各组大鼠脑组织SIRT1、PGC-1α、p-FOXO3α表达结果

3 讨论

缺血性眩晕主要以椎-基底动脉、大脑后动脉等后循环供血不足为主，该现象长期存在可使小脑、枕叶、脑干等受血区域脑组织发生缺血性损伤，产生神经功能障碍，从而引发相关症状。因此，单纯的对症抗眩晕对于病情进展没有良好的抑制效果，寻找有效药物保护缺血脑组织才是治疗的关键。在中医理论中，缺血性眩晕也属于“眩晕”范畴[10]，病机十分复杂，主要包括“虚”“风”“痰”“瘀”4个方面，治疗上常以健脾补虚、平肝熄风、涤痰定眩、活血化瘀等为主。此次主要探讨涤痰止晕方对于缺血性眩晕大鼠脑组织及SIRT1信号通路的影响。涤痰止晕方中白术性温，味苦甘，能健脾益气，燥湿利水，为“补气健脾第一药”；陈皮性温，味苦辛，可理气健脾，燥湿化痰；天麻性辛温，味甘平，能平肝息风，定惊；薏苡仁性凉，味甘淡，可健脾渗湿；石菖蒲性温，味苦辛，能化湿豁痰，开窍醒神；半夏性温味辛，可燥湿化痰，降逆止呕；川芎性温味辛，能行气开郁，祛风燥湿，活血止痛；赤芍性微寒微苦，有清热凉血，活血化瘀之效。全方药物配伍得当，共奏健脾补虚、平肝熄风、化痰开窍、行气活血之效。王久敏等[11]研究认为，涤痰止晕方能有效改善阵发性位置性眩晕患者的症状。现代药理研究也显示，天麻中的主要成分天麻素具有扩张脑血管、改善脑供血、镇静安眠、保护神经细胞等作用，对缺血性眩晕大鼠有确切的治疗效果；[12]川芎嗪是川芎中的活性成分，能通过抗氧化、抗凋亡途径保护脑组织和神经系统，与天麻素联用能有效改善老年患者眩晕症。[13]

在本研究中，笔者采用不同浓度的涤痰止晕方对缺血性眩晕模型大鼠进行干预，结果发现，与模型组比较，涤痰止晕方低、中、高浓度组和盐酸地芬尼多组大鼠逃避电击潜伏期较短，其中涤痰止晕方低浓度组>涤痰止晕方中浓度组>涤痰止晕方高浓度组和盐酸地芬尼多组(P<0.05)，缺血性眩晕模型大鼠前庭感受器及前庭神经核供血不足，容易在受到旋转刺激的情况下出现平衡障碍，无法因电刺激而迅速跳上平台躲避，使得逃避电击潜伏期延长，而上述研究结果表明，涤痰止晕方能剂量依赖性的缩短模型大鼠逃避电击潜伏期，即有效减轻缺血性眩晕相关症状，起到较好的治疗效果。

能量代谢障碍以及氧化应激反应均是导致缺血性脑损伤的重要原因和机制。Lac和LDH均为能量代谢相关指标，Lac是脑组织无氧糖酵解的产物，需要在LDH的催化作用下转化为丙酮酸，才能进行有氧代谢，为脑组织提供可用能量，生理情况下，神经系统以有氧代谢为主，脑组织内Lac、LDH含量均较少，而缺血性眩晕发生时，局部脑组织缺血缺氧导致Lac、LDH水平异常升高，可以作为反映脑缺血损伤程度的指标。[14]另外，脑缺血缺氧还能刺激氧自由基生成，直接导致神经元氧化损伤。SOD属于重要的自由基清除酶，与肌体抗氧化能力有关；MDA则是脂质过氧化代谢产物，可反映氧化应激反映程度。[15]此次研究显示，模型组比较，涤痰止晕方低、中、高浓度组和盐酸地芬尼多组大鼠脑组织Lac、LDH、MDA水平较低，SOD水平较高，涤痰止晕方高浓度组和盐酸地芬尼多组与模型组差异最为明显，表明涤痰止晕方能明显改善模型大鼠脑组织能量代谢，减轻氧化应激反应造成的脑组织损伤，控制病情进展。

关于涤痰止晕方的具体作用机制，笔者从SIRT1信号通路方面进行了探讨。SIRT1属于烟酰胺腺嘌呤二核苷酸依赖性的组蛋白去乙酰化酶，在肌体内广泛分布，能够调节多种细胞功能，发挥神经保护作用。[16]PGC-1α和p-FOXO3为SIRT1的下游分子，PGC-1α能补偿神经细胞线粒体的功能下降，在氧化损伤中保护神经细胞，[17]还能活化能量代谢相关的因子，保护脑组织能量供应；p-FOXO3则为细胞应对氧化应激的调节剂，能够直接促进SOD表达，也能于PGC-1α形成复合体上调抗氧化基因表达，防止氧化应激引起细胞损伤和凋亡。本研究结果显示，与模型组比较，涤痰止晕方低、中、高浓度组和盐酸地芬尼多组大鼠脑组织SIRT1、PGC-1α、p-FOXO3α表达水平较高，其中涤痰止晕方低浓度组<涤痰止晕方中浓度组<涤痰止晕方高浓度组和盐酸地芬尼多组(P<0.05)，表明涤痰止晕方能上调SIRT1及下游分子PGC-1α、p-FOXO3α表达水平，激活SIRT1信号通路，从而改善脑能量代谢，抑制氧化应激反应。

综上所述，涤痰止晕方能剂量依赖性的缩短缺血性眩晕大鼠逃避电击潜伏期，改善脑组织能量代谢，抑制氧化应激反应，其作用可能与上调SIRT1信号通路活性有关。