鼻腔给予rhEPO对血管性痴呆大鼠学习记忆能力及视网膜功能的影响

周彦慧

随着我国人口结构逐渐老龄化，血管性痴呆的发病率呈逐年上升趋势，其致死率和致残率给社会和家庭带来严重的负担。部分血管性痴呆病人并非脑血管本身的原因，20%～30%是由于颈动脉狭窄所致[1]。眼动脉是颈内动脉的重要分支，大多数情况下直接起源于颈内动脉，极少数情况下可从脑膜中动脉发出[2]。颈内动脉狭窄可致眼部供血不足[3]，一系列眼部缺血性表现会随之出现。因此，积极探索其发病机制及有效的药物治疗方法，具有重要的临床意义。近期研究表明，促红细胞生成素(EPO)在急性脑缺血中，通过清除自由基、抑制细胞凋亡、促进神经再生等多种途径发挥脑保护作用[1-2]，但EPO对慢性脑缺血的影响报道尚少[3]。本实验通过鼻腔给予血管性痴呆大鼠重组人促红细胞生成素(rhEPO)，通过Morris水迷宫行为学测试其学习记忆能力，采用苏木精-伊红(HE)染色观察大鼠视网膜组织形态结构及视网膜节细胞(retina ganglion cell，RGC)数量的变化，进一步探讨rhEPO对血管性痴呆大鼠认知功能及视网膜的保护作用。

1 材料与方法

1.1 材料 成年健康无眼疾的雄性SD大鼠24只(裂隙灯下检查角膜透明，瞳孔等大等圆，虹膜血管清晰，晶状体无混浊)，体重300～340 g。由山西医科大学实验动物中心提供。

1.2 动物分组及处理 将24只大鼠随机分为假手术组、对照组和实验组，各8只。对照组和实验组均以结扎双侧颈总动脉建立血管性痴呆模型。造模后3 d开始，实验组采用rhEPO(沈阳三生制药有限责任公司)干预，假手术组与对照组以同样方式给予等量生理盐水。8周后行Morris水迷宫测试并摘取眼球和脑组织，行HE染色。

1.3 模型制作 结扎双侧颈总动脉制备慢性脑缺血模型[3]。大鼠术前12 h禁食，4 h禁水。用5%的水合氯醛(6.5 mL/kg)腹腔注射麻醉大鼠，约5 min后仰卧固定于手术台上，备皮、消毒(碘伏及乙醇)，逐层剪开颈前部正中处的皮肤、黏膜，钝性分离颈部肌肉，待暴露双侧颈总动脉及迷走神经，慢慢分离颈总动脉和迷走神经，注意避免金属器械过度牵拉和钳夹。在双侧颈总动脉分出颈内动脉和颈外动脉的根部，用3号手术缝线双重结扎双侧颈总动脉并切断血管。最后，用甲硝唑注射液清洗伤口，逐层缝合。待大鼠苏醒后，送至有通风设备的动物房继续常规饲养。

1.4 给药方法 50 g/L水合氯醛将大鼠麻醉，用1 mL注射器将150 U(125 μL)rhEPO交替滴入大鼠的左右鼻孔。每周给药1次，共8周。每次给药时堵住对侧鼻孔，给药完毕后拔除软管，保持以上姿势30 min，以免药物流失。去除在滴入过程中有吞咽、口内有液体流出的大鼠[3]。

1.5 Morris水迷宫测评学习记忆功能 大鼠于实验前1 d进行Morris水迷宫试游，选取24只(2 min内登上隐匿平台)进入分组。两组大鼠分别在造模前及造模后8周进行行为学测试。测试期间保持水迷宫内外的参照物不变。

1.5.1 定位航行实验 用于测量大鼠学习能力。所有大鼠连续训练5 d，每天训练4次，每次训练的时间间隔为1 h，每次均将大鼠面向池壁不同象限点轻柔放入水中，记录其四肢登上隐匿平台的时间，即逃避潜伏期。设定大鼠在平台上停留时间5 s，游泳时间120 s。如果120 s内大鼠未找到平台，人为将其引上平台，其逃避潜伏期计120 s。平均逃避潜伏期的数值越小表明大鼠获取经验的能力越强。

1.5.2 空间探索实验 用于测量大鼠记忆能力。实验第6天撤出平台，从原平台所在象限对侧的象限点将大鼠面向池壁轻轻地放入水中，自动记录大鼠在120 s内穿越目标区的次数。撤除平台后，以大鼠穿越原平台位置的次数判断记忆能力，数值越大，记忆能力越好。

1.6 标本取材及制备 50 g/L水合氯醛(0.65 mL/100 g)腹腔注射麻醉大鼠，剪开胸腔暴露心脏。穿刺针迅速插入心尖，剪开右心耳，用200～240 mL的生理盐水快速冲洗，然后先快后慢灌注40 g/L多聚甲醛(pH值7.4)250～400 mL，至大鼠四肢抽搐、肝脏发白、身体僵硬。在眼球12：00 方位做好标记后，立即摘取眼球。脑干处离断大脑，打开颅腔，取出脑组织。

1.7 病理组织学观察 光学显微镜下观察大脑皮层、海马CA1区及视网膜的病理改变。用图像分析软件计算大脑皮层厚度，厚度为内外皮层对应点之间连线的距离，一张片取5处，每张片取其平均值。

2 结 果

2.1 Morris水迷宫行为学检测结果

2.1.1 定位航行实验 与假手术组比较，对照组逃避潜伏期明显延长，差异有统计学意义(P<0.05)，提示血管性痴呆大鼠学习能力降低。与对照组比较，实验组逃避潜伏期明显缩短(P<0.05)，提示rhEPO可改善血管性痴呆大鼠的学习能力。详见表1。

表1 3组大鼠逃避潜伏期比较(±s) 单位：s

2.1.2 空间探索实验 与假手术组比较，对照组穿越平台次数减少，差异有统计学意义(P<0.05)，提示血管性痴呆大鼠记忆能力减退。与对照组比较，实验组穿越平台次数增加，差异有统计学意义(P<0.05)。提示rhEPO可改善大鼠记忆能力。详见表2。

表2 3组大鼠穿越平台次数比较(±s) 单位：次

2.2 病理组织学检查结果 对照组大脑皮层及海马CA1区锥体神经元数目减少，胞体萎缩，细胞排列紊乱，细胞核固缩、溶解、消失，周围伴空泡样变性；假手术组及实验组锥体细胞排列紧密，偶见胞体缩小，细胞形态与正常接近。假手术组与实验组大鼠视网膜层次结构清楚，各层细胞排列整齐，细胞形态正常。对照组大脑皮层及视网膜厚度变薄萎缩，视网膜结构紊乱加重，视网膜神经节细胞计数减少，可见空泡、水肿样改变。

3 讨 论

国内外研究证实，EPO对多种脑损伤及视网膜病变模型具有多层次的神经保护作用，但多数集中于急性脑损伤及糖尿病视网膜病变模型中。EPO对中枢神经系统的保护作用机制通过抗谷氨酸兴奋毒性、抗神经元凋亡、抗氧化清除自由基、抗炎症等起作用[4-7]。兴奋性氨基酸(excitatory amino acid，EAA)主要包括谷氨酸(glutamate，Glu)和天冬氨酸(aspartate，Asp)，脑内以Glu为主。在缺血性脑损伤中，EAA可以通过下列机制加重神经元损伤：①脑缺血缺氧导致的能量代谢障碍可造成细胞膜Na+-K+-ATP酶活性下降，胞外K+浓度显著升高，神经元去极化，Glu大量释放；②EAA主要通过Ca2+超载介导细胞损伤，缺氧时Ca2+向细胞外转运减少，被肌浆网摄取减少，均造成细胞内Ca2+浓度升高。胞内Ca2+浓度升高可激活磷脂酶A2和磷脂酶C，使膜脂质降解，并释放大量花生四烯酸(arachidonic acid，AA)、白三烯和血小板活化因子(platelet activating factor，PAF)等活性物质，使血管收缩，血脑屏障破坏，EAA还可刺激一氧化氮合酶(nitric oxide synthase，NOS)产生过量的一氧化氮(nitric oxide，NO)，加重神经元损伤。EAA在各种脑损伤特别是缺血性脑损伤的发病机制中起重要作用。神经元以皮质第3、5、6层细胞，海马锥体细胞和小脑蒲肯野细胞最为敏感，在缺血缺氧时最先受累。缺血中心区及缺血半暗带是一个动态的病理生理过程，随着缺血程度的加重和时间的延长，中心坏死区逐渐扩大，缺血半暗带逐渐缩小。半暗带内神经元的病理改变在一定时间内是可逆的，如何在此时间窗内进行有效的干预治疗，进一步减少脑组织损伤是脑梗死治疗的重点。Siren等[8]对大鼠脑梗死组织切片进行末端脱氧核糖核苷酸转移酶介导的脱氧尿苷三磷酸酶标(TUNEL)发现，EPO使局部缺血性半暗带内的阳性标记的凋亡神经元明显减少，甚至消失。

眼缺血综合征多为内科全身病的局部表现，如高血压、动脉硬化、糖尿病等，可引起严重的后果，并成为老年人的多发病。相关研究发现，眼部缺血综合征是缺血性脑病及缺血性心脏病的早期迹象，眼部缺血综合征与脑、眼部缺血性疾病的发生有显著的相关性，所以，眼部缺血性的颈动脉狭窄与脑卒中的发生密切相关。国内对于颈动脉狭窄致眼缺血疾病的研究中，采用手术方法治疗颈动脉狭窄，能够迅速缓解眼部缺血症状。然而国外对于眼部缺血综合征的最新研究表明，早期诊断治疗，恢复动脉的灌注，对于眼部缺血综合征病人视功能的保存至关重要，并且能减少这种致盲性眼病的患病风险。

鼻腔给予rhEPO治疗血管性痴呆效果较好，这种新的治疗途径可以使药物更好地通过血脑屏障，既可以降低全身给药的影响，又能减少药物的不良反应。但rhEPO对血管性痴呆的保护作用机制有待进一步研究。