基于电子鼻、气-质联用技术和感官评价方法优化海带发酵脱腥工艺

顾赛麒，胡彬超，张月婷，鲍嵘斌，王苏宁，邹琳，周绪霞，丁玉庭*，栾露琴，张晨超，唐文燕

1(宁海县浙工大科学技术研究院，浙江 宁海,3156001) 2(浙江工业大学 食品科学与工程学院，浙江 杭州,310014) 3(国家远洋水产品加工技术研发分中心(杭州)，浙江 杭州,310014)

海带(Laminariajaponica)是我国重要的海水养殖品种，2018年全国养殖总量已达152.3万 t[1]。海带营养成分丰富，但自身腥味较重，对其食用品质可能造成不利影响[2-3]。海带腥味物质主要包括醛类、醇类、烯酮类、有机溴代物或碘代物等[4-6]。目前，海带脱腥方法可分为物理法、化学法和生物法[7]，其中生物法具有脱腥效率高、工艺条件温和等优点，应用最为广泛，具体机理是：在微生物的作用下，小分子的腥味物质经合成、转化或结构修饰等作用，最终成为无腥味成分。据报道，酵母菌是最常用的发酵菌种，其脱腥效果较好[8]。

在酵母法脱腥过程中，酵母浓度、发酵温度和发酵时间等因素对海带脱腥效果影响显著。酵母菌初始浓度过低或者发酵时间过短，可能导致腥味物质消降不完全；反之，则可能造成菌体大量增加，引入菌体异味而导致风味品质下降。此外，随着发酵时间的延长，发酵过程中产生的酸类物质(H2CO3等)不断积累，使发酵液pH显著下降，影响酵母菌活性。同时，若发酵温度过高或过低也会对酵母菌活性造成影响，进而影响最终脱腥效果[8]。

现阶段对海带脱腥的常用评价手段有感官评价、电子鼻和气相色谱-质谱联用。感官评价能客观反映消费者对样品的接受度或喜好性，但易受人员因素的影响[9-10]。电子鼻可区分不同样品气味轮廓的细微差异，但无法对样品中的某一挥发性成分进行鉴别[11-12]。气相色谱-质谱联用是最常用的挥发性风味分析手段，其结果与使用的前处理技术密切相关。整体材料吸附萃取作为一种逐渐兴起的前处理技术，基于硅胶、活性炭和十八烷基硅烷等材料为一体的高交联性新型吸附剂，对不同极性和沸点的化合物均能实现有效吸附，适用范围较广[13]。上述3种评价手段各有利弊，本研究尝试将其联用后优化海带发酵脱腥工艺，旨在为海带制品生产企业提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

海带，2017年3月购自杭州近江水产市场；安琪耐高温酿酒高活性干酵母(货号：E80000012)，河南洲洋生物科技有限公司；葡萄糖、NaCl、无水乙醇(均为分析纯)，上海安谱实验科技股份有限公司；2,4,6-三甲基吡啶标准品、C6～C15正构烷烃标准品(均为色谱纯)，美国Sigma-Aldrich公司。

1.2 仪器与设备

FA 3204B电子分析天平，上海仪天科学仪器有限公司；DF-101S集热式磁力搅拌器，上海越众仪器设备有限公司；LRH-350F生物培养箱，常州市金坛勒普仪器有限公司；RCC18固相萃取整体捕集剂(规格2.9 mm×5 mm，孔径1 mm)，日本GL Sciences公司；7890A/5975C单四级杆气相色谱-质谱联用仪，美国安捷伦科技有限公司；Fox4000型电子鼻，法国阿尔法莫斯公司。

1.3 试验方法

1.3.1 脱腥处理

酵母活化液制备：称取10 g葡萄糖和0.3 g NaCl充分溶解于1 000 mL去离子水中，分别向其中加入0.5、1.0、1.5、2.0和2.5 g酿酒酵母干粉，配成质量浓度梯度为0.5、1、1.5、2和2.5 g/L的酵母菌液，将上述系列菌液置于25 ℃、120 r/min的恒温摇床中活化20 min，所得活化液中酵母菌数分别为7.86、8.14、8.32、8.46和8.56 lg CFU/g。

海带脱腥工艺：将海带剪成1 cm×1 cm左右、大小均一的小块。称取10 g海带样品，装入内装100 mL酵母活化液的具塞锥形瓶中，置于转速为120 r/min的恒温摇床中，分别于不同温度下(24、26、28、30和32 ℃)脱腥不同时间(30、60、90、120和150 min)。脱腥完毕的海带洗净后用吸水纸吸干表面，混合均匀后待测。

1.3.2 电子鼻分析

称取2.00 g海带样品，装入10 mL顶空瓶中，采用FOX4000型电子鼻进行测定。仪器参数：平衡温度60 ℃，平衡时间600 s，进样速度2 000 μL/s，进样体积2 000 mL，载气为洁净空气，流速150 mL/min，数据采集周期600 s。每个样品重复测定5次。

1.3.3 整体材料吸附萃取-气相-质谱分析

称取2.00 g海带样品，装入15 mL顶空进样瓶中。将5个RCC18空心圆柱体吸附子以固定装置相连，置于顶空瓶中样品正上方。将顶空瓶放入60 ℃恒温水浴锅中萃取50 min，待萃取完毕后手动取出吸附子装入热脱附管，送入热解析单元中热脱附进样。每个样品重复测定3次。

热解析单元：不分流模式，初始温度40 ℃，以180 ℃/min升至240 ℃，保留5 min。为防止进样量较大引起的峰形变形，配制了液氮冷阱系统：初始温度-40 ℃，平衡30 s，以12 ℃/s升至270 ℃，保留15 min。

GC条件：DB-5 MS毛细管柱(60 m×0.32 mm, 1 μm)，汽化室温度240 ℃。柱温起始40 ℃，以4 ℃/min升至100 ℃，再以2 ℃/min升至150 ℃，最后以8 ℃/min升至240 ℃，保留5 min。载气流量1.2 mL/min。MS条件：EI能量源；电子能量70 eV，质量扫描范围m/z35～450，离子源温度220 ℃，传输线温度250 ℃。

定性、定量方法：将挥发物质谱图与NIST 2014谱库进行比对，仅报道正反匹配度均>800的鉴定结果，同时计算各个挥发物的线性保留指数(linear retention index，LRI)，将其与文献中的数值进行比对后定性[14]。在海带样品中加入10 μL质量浓度为10-5g/mL的内标物2, 4, 6-三甲基吡啶，通过计算待测挥发物与内标物峰面积的比值来求得各挥发物的质量浓度。

1.3.4 感官评价

采用划线法[15]对海带整体气味可接受度进行评分。

1.4 数据统计分析

采用SPSS 17.0软件和Origin 8.0软件进行处理分析，差异显著性分析由最小显著差数法完成。

2 结果与分析

2.1 电子鼻技术分析不同发酵工艺对海带腥味脱除的影响

图1～图3中第1与第2主成分贡献度之和均>90%，表明经不同条件发酵后，海带样品整体气味轮廓差异均十分显著，样品信息损失率<10%。判别指数主要用于评定不同组样品数据点间的区分程度，最大值为100，其值越大表明区分效果越好[8]。图1～图3判别指数均在84以上，表明经不同发酵条件处理后，海带样品整体气味轮廓均无重叠，区分度较好。

图1 不同酵母浓度处理海带样品电子鼻结果 主成分分析图Fig.1 PCA plot of E-nose results ofLaminaria japonica fermented with different yeast concentrations

图1显示，酵母质量浓度分别在0.5、1 g/L以及1.5、2 g/L时，样品数据点均较为接近；当酵母质量浓度达到2.5 g/L时，样品数据点与其他浓度组间距离显著增大，分析可能与酵母质量浓度过高引入菌体异味有关。由图2可知，发酵温度在24～28 ℃时，样品各组数据点间距离较为接近；而发酵温度>30 ℃时，样品数据点与其他组间距离不断增大，表明过高的发酵温度可能对脱腥后海带样品气味产生不利影响。图3显示，随着发酵时间的延长，样品数据点与原料海带数据点间距离不断增大，推测海带发酵过程中腥味物质的脱除可能存在时间积累效应。此外，通过比较各组样品数据点与原料海带数据点质心间的平均距离，发现存在“酵母质量浓度>发酵时间>发酵温度”的趋势，表明酵母质量浓度可能对海带脱腥效果存在最显著的影响。

图2 不同发酵温度处理海带样品电子鼻结果 主成分分析图Fig.2 PCA plot of E-nose results of Laminaria japonica fermented under different temperatures

图3 不同发酵时间处理海带样品电子鼻结果 主成分分析图Fig.3 PCA plot of E-nose results of Laminaria japonica with different fermentation time

2.2 不同发酵工艺对海带挥发性风味物质的影响

2.2.1 海带挥发性风味物质分析

从原料海带中共检测出42种化合物，其中气味活度值(odor activity value,OAV)>1的化合物共有己醛等10种，可定义为海带中的活性气味物质。经不同发酵条件处理后，无论是挥发物种类、总浓度,还是OAV值总和均发生了不同幅度的下降。当酵母质量浓度为1.5 g/L时，挥发物种类从原来的42种减少为25种，总质量分数降低141.13 ng/g，OAV值总和降低36.96。当酵母发酵温度为28 ℃时，挥发物种类减少16种，总质量分数和OAV总和降幅最大，分别为49%和40%。当发酵时间为120 min时，共有18种挥发物被消除，挥发物总质量分数和OAV总和降至最低，分别为138.88 ng/g和52.68 ng/g。综上所述，确定海带发酵脱腥的最优工艺条件为：酵母质量浓度1.5 g/L、发酵温度28 ℃、发酵时间120 min。

醛类气味阈值较低，对海带整体气味贡献最为突出。经最优工艺发酵后，6种气味活性醛类OAV值均发生了不同程度消降，其中己醛、庚醛和癸醛的消降程度较多，分别为18.77、4.30和4.62。己醛被报道是海带的典型腥味物质，呈鱼腥味、青草味等不良气味特征[16]。除己醛外，其他直链醛和含不饱和键的烯醛也被报道是海带中的异味物质，而苯甲醛具有苦杏仁味[17]，经发酵后它们质量分数和活性值均下降显著。

醇类对海带整体挥发性风味有重要影响。经最优工艺发酵后，醇类总质量分数和OAV值总和下降近50%，其中3种不饱和烯醇贡献较显著：1-戊烯-3-醇和2-辛烯-1-醇的消降率达100%，而1-辛烯-3-醇被报道是海带中典型的腥味物质(呈鱼腥味和青草味)[18]，发酵后其OAV消降值达3.51，占醇类消降量的46%。段吴勇[19]报道，酵母发酵后海带中醇类物质种类显著减少、浓度大幅下降，与本研究结果一致。

酮类是海带中常见的风味组分，经最优工艺发酵后，2-庚酮、1-辛烯-3-酮、3-辛酮和苯乙酮这4种酮类被完全消除，占所有酮类总数的一半。1-辛烯-3-酮是原料海带中浓度最高的酮类物质，呈典型的鱼腥味，有研究者证实海带发酵后1-辛烯-3-酮的脱除率为100%[19]。原料海带中仅有2-庚酮具有气味活性，在发酵海带中未被检出。总体而言，酮类化合物因其OAV值总和较低，故对海带整体气味贡献不大[20]。

芳香类主要来自于海泥和水体等外部环境，通过生物富集作用在海带中积累，一般具有刺激性和石油味等不良风味。采用最优工艺发酵后，海带中芳香类的OAV值总和显著下降(达2.45)，其中联苯作为该类唯一的气味活性物质贡献显著，占芳香类OAV总消降值的82%。

烃类因其自身阈值较大，故对海带挥发性风味贡献较小。2-乙基呋喃属含氧杂环类化合物，具有刺激性气味，是海带中另一种重要的气味活性物质，经发酵后的海带中，其浓度已降至降至阈值以下，不具气味活性。三碘甲烷是原料海带中唯一被检出的含碘化合物，采用最优工艺发酵后其未被检出。

2.2.2 脱腥处理中海带中气味活性物质变化

由附表1(kns.cnki.net/KCMS/detail/11.1802.TS.20200715.1751.008.html)和图4可知，经不同脱腥工艺处理后，海带中10种气味活性物质的OAV消降值和消降率均>0，表明经酵母发酵后，海带自身气味活性发生了降低。除2-辛烯醛和壬醛之外，其余8种气味活性物质的OAV消降效果均较为显著，其中己醛、癸醛和1-辛烯-3-醇的OAV消降值较大(最大消降值均>3，其中癸醛达18以上)，而己醛、庚醛、癸醛、2-庚酮和2-乙基呋喃的消降率较高(最高消降率均>40%，其中2-庚酮达100%)。总体而言，原料海带经不同发酵条件处理后脱腥效果均较好，但其中也存在一定差异性。比较图4-a和图4-d可知，当酵母质量浓度为1.5 g/L时，发酵后海带样品的OAV消降值及消降率均最高，表明其脱腥效果最好；由图4-b和图4-e可知，当发酵温度为28 ℃时，海带脱腥效果最佳；由图4-c和图4-f可知，当发酵时间为120 min时，海带腥味消减最显著。

a-酵母质量浓度对OAV消降值的影响;b-发酵温度对OAV消降值的影响;c-发酵时间对OAV消降值的影响;d-酵母浓度对OAV 消降率的影响;e-发酵温度对OAV消降率的影响;f-发酵时间对OAV消降率的影响图4 不同脱腥工艺对海带气味活性物质的OAV消降值的影响Fig.4 Effect of different deodorization processes on the OAV of Laminaria japonica 注：小写字母不同代表各组数据间具有显著性差异(P<0.05)

2.3 脱腥处理后感官评分

酵母质量浓度1.5 g/L时，海带样品感官评分升至最高的70.5分，此质量浓度下，脱腥后海带中挥发物的总质量分数与OAV值总和均达最低值(146.42和54.79 ng/g)。主要原因可能是：0～1.5 g/L时，酵母质量浓度逐渐升高，发酵作用逐步加强，海带中的腥味物质消降效果越显著；但当酵母质量浓度>1.5 g/L，则可能引入不良发酵异味，导致感官评分下降。

发酵温度28 ℃时，脱腥后海带感官评分达到最高，而此温度下脱腥后海带样品挥发物总浓度值和OAV总和均低于其他温度组。分析原因是：在24～28 ℃时，酵母增殖速度随温度增大，海带中的腥味物质可能发生结构破坏或者经生物合成、修饰等反应导致其腥味特征消失；当温度继续升高至30 ℃(酵母菌的最适生长温度)时，菌体可能大量增殖引入不良异味[21]，造成海带样品感官评分下降。

发酵时间120 min时，感官评分达到最大值，而挥发物总质量分数和OAV总和达到最小值，两者可相互印证。在30～120 min内，酵母菌快速增殖，腥味物质经消降或生物转化作用而减少。随着发酵时间达到150 min，增殖逐步进入稳定期，菌体数量大量积累，酵母菌体与生成的次生代谢产物均可能造成海带中异味物质的增加，造成感官评分下降。

综上所述，感官评分与挥发物总质量分数以及OAV总和变化规律具有较强一致性，分析其相关性发现(表1)，不同脱腥条件下，感官评分与挥发物总质量分数以及OAV总和的相关性(分别以RAB和RAC表示)总体较高，绝对值均>0.8，且存在|RAB|<|RAC|的规律，表明与挥发物质量分数相比，OAV值与感官评分间的相关性更强。此外，无论是RAB还是RAC，均存在发酵时间>发酵温度>酵母质量浓度的规律，表明不同发酵时间海带样品感官评分与挥发物总质量分数和OAV总和间的相关性最好。

表1 发酵条件对感官评价的影响及其 相关性分析Table 2 Influence of fermentation conditions on sensory evaluation and the correlation analysis

3 结论

不同发酵条件下海带样品整体气味轮廓均无重叠，区分度较好。从原料海带中共检出7大类42种挥发物，筛选得到以己醛为代表的10种气味活性物质。根据挥发物种类、总质量分数和OAV总和，确定了海带脱腥的最优工艺：酵母质量浓度1.5 g/L、发酵温度28 ℃、发酵时间120 min。所有气味活性物中，己醛、癸醛和1-辛烯-3-醇的OAV消降值较大；己醛、庚醛、癸醛、2-庚酮和2-乙基呋喃的消降率较高；2-辛烯醛和壬醛的消降效果不显著。经最优工艺发酵后，海带中挥发物种类减少18种，挥发物总质量分数降低148.77 ng/g，气味活性值总和减少39.07，感官评分升至最大值70.5。无论何种发酵条件下，感官评分与OAV值总和间的相关性始终高于与挥发物总质量分数间的相关性。