同一病人石蜡组织HPV检测结果不同的分析

刘金星　况薇

【摘  要】目的：针对同一病人的石蜡组织PCR结果不同的现象，分析可能出现的原因及应对措施。方法：采用双盲翻倍实验方法，对两组PCR结果进行分析。结果：A、B两组实验结果显示2张（±）、4张（+）、8张（+）。结论：石蜡取材准确与否，直接影响PCR扩增结果准确性，为避免结果不一致，需先镜下定位取材部位，装管的石蜡组织片厚度为5微米，数量以大于两张为宜。

【关键词】石蜡;HPV检测

【中图分类号】R737      【文献标识码】A      【文章编号】1672-3783（2020）06-0292-01

以宫颈癌为代表的宫颈病变是一种发病率较高的妇科疾病，是威胁妇女健康的最为严重的疾病之一，90%的宫颈癌是由人乳头瘤状病毒持续感染引起[1-3]，发病率近十年来持续上升并趋于年轻化，目前，HPV分型的检测方法主要有杂交法和以聚合酶链式反应（PCR）为基础的两大类，我们采用PCR体外扩增和DNA反向点杂交相结合的HPV基因分型检测技术，对同一患者的宫颈石蜡组织进行双盲翻倍实验，对实验结果进行分析，旨在讨论出现结果不同的原因及解决方法。

1 材料与方法

1.1 材料  leica石蜡切片机、刀片、镊子、75%酒精、医用棉签、1mlEP管、记号笔、待检石蜡组织块、裂解液、金属浴、离心机（13000r/min）、加样枪（1-10ul/10-1000ul）、PCR扩增仪、膜条、PCR杂交仪、自备试剂20×SSC（175.3gNacl、88.2g柠檬酸钠，加蒸馏水800ml溶解，用浓盐酸调PH值至7.0，定容至1000ml，高压灭菌保存）、10%SDS（20gSDS加蒸馏水180ml溶解，用1N HCL调制PH7.0，定容至200ml）、1M柠檬酸钠（294.1g柠檬酸钠加蒸馏水700ml溶解，用浓HCL调制PH5.0，定容至1000ml）、A液（100ml 20×SSC，10ml10%SDS加纯化水定容至1000ml，常温保存）、B液（25ml20×SSC，10ml10%SDS加纯化水定容至1000ml，常温保存）、C液（100ml 1M柠檬酸钠加纯化水定容至1000ml，常温保存）、显色液（19ml C液加入1mlTMB和1ul30%H2O2）等。

1.2 方法 镜下观察该患者大体HE切片，筛选出有细胞癌变的蜡块，由A、B两组实验人员分别以5um厚度，数量2张、4张、8张的方法装管取样。具体操作如下，实验人员佩戴口罩、帽子及医用手套，将待检蜡块修至最大切面后，用棉签蘸75%酒精擦拭切片刀两侧、刀座及石蜡组织切面，防止外源性生物污染，丢弃第一张组织切片，因为组织表面被酒精沾染，装管应避免酒精对后续实验的干扰，用无菌镊子选取2张、4张、8张组织片数分别装管标号备用，操作全程均应遵循无菌原则。将装有组织的EP管分别加入200ul裂解液，放入金属浴煮沸15min，然后离心5min，EP管内出现3层，上层石蜡、中间DNA悬液、下层待检组织碎屑，如图1，选取中间悬液5ul加入扩增样品管，震荡均匀后离心数秒，防止反应液贴壁，放入PCR扩增仪，扩增2h36min后，变性10min进行杂交显色，杂交流程：A液与膜条预热后加样，摇床45min→B液洗膜10min→A液+POD孵育30min→A液洗膜5min两次→C液洗膜5min两次→显色液10min→水洗。

2 结果

经过双盲翻倍实验方法，得出A组显色结果：2张（±）、4张（+）、8张（+），且阳性型号相同，实验膜条内参IC均显示，但2张内参比后两组稍弱，B组显色结果：2张（-）、4张（+）、8张（+），阳性型号相同，实验膜条内参IC均显示，如图2。

3结论

本试验操作简单，获取DNA样本充足，用酒精消毒避免组织污染方法有效且节省了耗材，对出现不同结果的原因，分析有以下几点：

①组织取样不到位，即目标细胞过少，从实验结果可以看出，2张（-）且内参信号弱，在取材时可选取3-5张组织切片为宜;

②切片总面积的增加其表面黏附的PCR抑制因子将可能增多，为避免过多组织干扰，我们可选取目标组织定位取材，切片厚度固定5um;

③甲醛除本身可造成DNA分子损伤外，其与氧化性物质接触后形成的甲酸改变环境PH从而影响DNA分子稳定性，使核酸中嘌呤基的β糖苷键容易发生水解而导致DNA链断裂[9]，提取目的DNA时会造成干扰，我们应避免使用存放过久的石蜡块进行实验;

④加样时DNA量不足导致扩增失败，在加样时，应将枪头沿EP管壁轻轻插入，破石蜡层后吸取DNA悬液;

⑤当感染多种HPV病毒时，由于HPV可检出期比较短，大部分妇女HPV感染期比较短，一般在8-10个月便会消失，有约10%-15%的35岁以上女性有持续感染情况，这些人有更高的患癌风险，在检测HPV分型时，会出现多次检查分型不同的情况。

⑥经研究表明，HPV致癌作用与HPV DNA的整合有关，宫颈鳞状上皮与柱状上皮连接处是HPV的易感部位，HPV感染宿主细胞后，会以两种形式存在于宿主细胞中，即细胞染色体的整合状态和染色体的游离状态，而宫颈癌中绝大部分病毒以整合状态存在，浸润性宫颈癌中，则两种状态共存，但通过镜下观察，癌细胞的分布并不均匀，在进行取样时，还应镜下先选取病变部位，再行装管实验，当取材不充分时，同一组织块会检测出不同结果的现象，是由于病毒的分布并不均匀。

4总结

通过本例实验，我们得知影响实验结果的主要原因及众多干扰因素中，组织取材不到位，很大程度上影响实验的结果，也通过查找相关文献得以辅证，为避免实验结果的差异性，取材前筛片选块，装管组织厚度5um，张数大于2张，小于8张为宜，避免组织浪费。

参考文献

[1] 陈晔， 顾芸， 耿建祥，等. 宫颈鳞癌组织中HPV感染型别分布情况的分析[J]. 国际检验医学杂志， 2019（16）.

[2] 贺仁娟， 赵敏. HPV E6/E7 mRNA檢测在宫颈病变中应用价值的探讨[J]. 实用妇科内分泌杂志（电子版）， 2018（1）.

[3] 徐来祥，张知彬，宋铭晶，等.福尔马林保存的动物标本基因组DNA的提取方法[J].动物学报，2004，48（2）：264-269.