CRISPRCas9技术在疾病治疗方面的应用

江芝瑶

【摘 要】CRISPR Cas9基因切割技术是近几年人们在基因水平研究上的新突破，它能够通过Cas9核酸酶实现对多个基因的切割，人们利用这个技术，能系统的了解各基因的功能和作用，并为许多遗传性疾病提供全新的治疗方式。该项技术主要通过干涉可分化干细胞、基因编辑重编程和修饰基因这三种途径来预防和治疗疾病，目前科学家们在这方面已经展开了许多研究，并取得了一定进展，实现临床治疗是CRISPR Cas9基因切割技术下一步最大的发展目标，未来该项研究也必定会获得更为突破性的进展。

【关键词】CRISPR Cas9技术;疾病;治疗

【中图分类号】R596.2【文献标识码】B    【文章编号】1002-8714（2020）07-0123-02

CRISPR Cas9基因切割技术作为在基因水平上的一项新研究，为现代医学领域的许多疾病治疗提供了一种全新的途径。它通过系统内的Cas9核酸酶对目标DNA进行切割，从而实现对患病基因的修复。由于CRISPR Cas9技术允许人们对基因进行高精度修复，因此对该技术展开深入研究和广泛应用对医学界有着重大的影响。

1 CRISPR Cas9基因切割技术介绍

CRISPR Cas9系统（Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats）序列系统线性排列在DNA链上，该系统对于原核生物来说，可以使自身体内的细菌在经历数次病毒攻击后自行形成免疫防御系统。

这三个功能区对于整个系统来说都有不同的作用，CRISPR序列相当于一个基因收集库，用来编码用来切割DNA的crRNA，它由多组重复序列组成，其中也包含小部分间区序列。Cas基因序列种类很多，有1-10等多种不同类型，它用来编码引导crRNA切割指定DNA链的Cas9核酸酶，而tracrRNA就是由CRISPR序列根据其收集到的细菌信息转录而来。

CRISPR Cas9技术的发现可以追溯到1977年，当时桑格发明了基因测序方法，而CRISPR Cas系统的发现就开始于细菌测序中。1987年，日本大阪大学的实验工作者在对一种大肠杆菌的碱性磷酸酶同工酶进行测序的过程中，发现在某段基因编码序列的终止密码子后存在一段由简单重复序列组成的DNA片段，同时在片段两端还存在一段不太长的特有序列，但由于当时关于生物的研究发展仍存在很多不足，学界并未对该现象展开更深入的研究。到了21世纪初，有研究者发现这种“简单重复序列”的系统在>40%的细菌中和>90%的古生菌中都有广泛存在，这种普遍性引起了一些科学家的重视，两年之后，这套“简单重复序列”被首次命名为CRISPR。经过科学家的不断深入研究，在2005年发现这种重复序列来自于噬菌体，并且有人推测这套系统与细菌和古生菌的获得性免疫有关，并在2007年第一次证实CRISPR的作用是获得性免疫。之后，对于CRISPR的研究更加注重各部分的功能和整个过程的形成。比如在2008年，人们发现Spacers可以转录形成crRNA起到指导Cas靶向性的作用，并且证实CRISPR的靶点是DNA。一年后，科学家们又发现了TypeIII-B结构，同时进一步得出CRISPR也能够对RNA进行切割的结论。在2011年，人们发现转录形成的tracrRNA和crRNA可以形成二聚体，并与Cas9组成复合体。更为重要的是人们在同一年还证实了CRISPR系统可以用在细菌和古生菌以外的其他物种，这为CRISPR Cas9技术在人类疾病中的应用做了铺垫。紧接着，科学家们又在体外证实了Cas能够对DNA进行切割，而2013年第一次证实CRISPR可以用于哺乳动物的编辑让该技术成功吸引了无数生物学研究者，同时，研究人员已成功在人類、小鼠、斑马鱼及拟南芥、水稻等物种上实现精确的基因修饰。

通过科学家们不断地深入研究，目前已知的CRISPR Cas系统主要有3种，分别是Type I、Type II和Type III。进一步根据cas基因种类分，还可以将Type II类型细分为Type IIA、Type IIB和Type IIC[1]。

2 CRISPR Cas9技术在疾病治疗方面的应用以糖尿病治疗为例

2.1糖尿病介绍

人体内胰岛素分泌相对或绝对不足均会导致糖尿病的产生。I型糖尿病为自身免疫性疾病，其从起病之初就伴随胰岛β细胞的凋亡。II型糖尿病最初的表现为胰岛素抵抗，其疾病末期也伴随胰岛β细胞的丢失。因此，治疗糖尿病最重要的工作就是寻找新胰岛β细胞。目前，应用CRISPR Cas9技术，可以实现从干细胞中分化、基因编辑和修饰基因三种途径来获取胰岛β细胞。

2.2 CRISPR Cas9技术在糖尿病治疗方面的应用

① 从干细胞中分化

人胚胎干细胞（hESCs）可以分化成胰岛细胞。前两种细胞也被称为人多能干细胞，它们在表达特定转录因子并激活或抑制特定信号通路后，可以定向分化为胰岛谱系细胞。在CRISPR Cas9技术出现以前，人们只能明确少数几种转录因子的功能，而仍有很多重要信息未被发现，CRISPR Cas9技术出现之后，人们能够利用该技术筛选胰腺发育时需要的关键因子，并确定其功能，从而推动人胚胎干细胞和人诱导多能干细胞分化成胰岛谱系细胞。不仅如此，CRISPR Cas9技术还能够实现将单个基因位点与患病症状相联系，方便医生针对症状寻找问题。随着人们对每个物质系统的研究，有科研小组通过CRISPR Cas9技术发现NEUROG3在人胚胎干细胞分化的过程中起到非常重要的作用;而另一组研究团队则对8个胰腺转录因子的作用进行了对照分析，发现PDX1不足也会影响胰腺内分泌发育;而一些中美科学家们结合CRISPR Cas9与其他一系列技术，发现胰岛素不足可来源于CDKAL1、KCNJ11、KCNQ1中的基因突变，同时他们还发现，T5224这种物质可以减少由于CDKAL突变而导致的胰腺β细胞缺失，进而将T5224这种化合物研发成T5224（AP-1抑制剂）这种化学药品，从而修复CDKAL1突变引起的胰岛β细胞缺失;人们还发现STAT3 K392R突变也会导致胰岛β细胞功能缺失，运用CRISPR Cas9技术可使突变恢复原来状态，防止诱导多能干细胞不正确的分化。在相关领域，人们已经利用小鼠开展了许多尝试，比如，有研究人员发现，插入Pax4基因可以使小鼠干细胞产生胰岛素;在鼠胰腺被膜下多注射间充斥干细胞也可促进胰岛素产生;把基因编辑后的胰高血糖素样肽1基因在小鼠皮肤细胞中培养，小鼠的体重和血糖水平在4个月的时间里得到了调节和控制[1]。

② 基因编辑

在胰腺外分泌细胞、肝脏细胞、肝胰胆管细胞和胃窦细胞可通过基因编辑变为胰岛素分泌细胞这一发现的基础上，科学家们可运用CRISPR Cas9技术在胰岛β细胞缺失后人工进行基因编辑，从而防止疾病发生。目前，人们已经筛选出进行基因编辑的转录因子最佳组合PNM，它包括了Pdx1、Ngn3和MafA三种因子，但将PNM注射入小鼠体内后发现，基因编辑效率只有20%。

③ 修饰基因

运用CRISPR Cas9技术可以修饰与引发糖尿病有关的22种相关基因，编辑单个基因是该项技术成功率相对较高的应用，但糖尿病属于多基因遗传病，因此难度也会相应提高。目前，修饰基因仍停留在导入正常基因来弥补缺陷基因的水平上。

2.3 展望

虽然CRISPR Cas9技术的运用为糖尿病治疗提供了三种新途径，但每种方法仍存在一定的问题。利用人体干细胞分化成胰岛谱系细胞，很有可能会产生免疫排斥反应;而基因编辑的效率与成熟度较低，同时不同的成熟体细胞间表观遗传学存在不同，基因编辑无法进入调控胰岛细胞的网络，编辑后的细胞仍无临床治疗功能;修饰基因则无法很好保证其安全性，效率也有待提高。针对以上这些问题，研究人员开发出了一套精确度更高的脱靶效应检测方法——“体内非靶点验证”，或也可尝试通过对Cas蛋白和sgRNA的改进来降低脱靶发生;为应对PAM序列的限制，人们同样也对Cas蛋白进行了改造，获得spCas9-NG这一变体，消除了PAM序列的限制，或也可使用Cas9直系同源酶;为应对效率低的问题，可以发明新的转染方式或是建立更加稳定的转导细胞系。

3 结语

CRISPR Cas9基因切割技术让人们能够在基因的水平上对其进行高精度的修改与编辑，这在生物学研究和医学上都是巨大的突破。虽然CRISPR Cas9技术尚未成熟，仍存在如脱靶现象等一系列问题，但研究人员一直致力于解决目前发现的CRISPR Cas9技术有可能引发的问题，并不断探索该技术未被发现的隐患，倘若CRISPR Cas9技术能进一步发展，那么它在研究各物质作用与功能、治疗疾病等方面都将大放异彩，成为人类强有力的研究工具。

参考文献

[1] 杨佳儒， 郭美華， 柳爱华， et al. CRISPR-Cas9的原理及其应用进展[J]. 昆明医科大学学报， 2016， 37（5）：118-122.