大鼠β-arrestin2基因过表达慢病毒载体的构建与鉴定*

陈思思， 周恒， 王继春， 谢菁， 周艳丽， 卢帅， 卢力

(武汉大学人民医院 心内科， 湖北 武汉 430060； 武汉大学 心血管病研究所， 湖北 武汉 430060； 心血管病湖北省重点实验室， 湖北 武汉 430060)

β-arrestins是G蛋白偶联受体，包含了β-arrestin1与β-arrestin2[1]。β-arrestins是一个关键性的调节因子，亦可与多种信号分子直接结合、并调节其活性，参与多种生物活动过程[2-4]。除了调节机体的炎症和免疫反应过程，β-arrestins还被发现是细胞迁移、凋亡中的关键调节因子[5-7]。血管内皮功能障碍是许多心血管疾病的发病基础，而内皮祖细胞通过迁移、增殖、凋亡等参与了血管内皮修复及新生血管形成过程[8-11]。目前对β-arrestin2调节内皮祖细胞过程中的作用尚不明确，所以本次试验采用基因重组技术建立β-arrestin2表达慢病毒载体，系统地研究基因功能对心血管疾病的作用。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1质粒和病毒 过表达质粒载体为GV492，元件顺序Ubi-MCS-3FLAG-CBh-gcGFP-IRES-puromycin，克隆位点为BamHI / AgeI，慢病毒辅助包装质粒为Helper1.0和Helper2.0，由上海吉凯基因化学技术有限公司提供。慢病毒包装细胞为293T细胞由美国ATCC公司提供。

1.1.2主要试剂和仪器 1 kp DNA ladder Marker(美国Fermentas)，In-FusionTMPCR Cloning Kit(美国Clontech)，250 bp DNA ladder Marker(上海捷瑞)，琼脂糖(上海赛百盛)，E001-02B Taq polymerase(上海SinoBio)，D4030A脱氧核糖核苷(deoxy-ribonucleoside triphosphate，dNTP)(日本Takara)，引物设计及合成(上海捷瑞)，限制性内切酶(美国NEB)，质粒抽提试剂盒(美国Promega)，改良伊戈尔培养基(dulbecco modified eagle medium，DMEM)(美国Hyclone)，琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒(北京天根)，胎牛血清(上海微科)，胰酶(上海化学试剂)，脂质体Lipofectamine 2000(美国Invitrogen)及HIV-1 p24 Antigen酶联免疫吸附测定(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)2.0试剂盒(北京达科为)；聚合酶链式反应(polymerase chain reaction，PCR)扩增仪(美国Applied Biosystems)，凝胶成像仪(上海天能)，ABI3730型全自动DNA测序仪(上海美季)，HI-9211K型细菌摇床(太仓华利达)，细菌培养箱(上海一恒)，稳压DNA电泳仪(美国BioRad)，Gilson移液器(法国吉尔森)，TGL-16G-A高速离心机(日本日立)。

1.2 方法

1.2.1目的基因片段的获取 根据Pubmed数据库中大鼠Arrb2(β-arrestin2，NM-012911)的cDNA序列，引物由上海捷瑞生物设计合成，予以PCR，得到目的基因(表1)。PCR反应体系配制：ddH2O、5×PS Buffer和dNTP Mix分别为32.5、10.0和4.0 μL、10 μmol/L上游和下流扩增引物均为1 μL、10 mg/L模板和PrimeStar HS DNA polymerase分别1.0和0.5 μL；PCR反应条件确定为98 ℃预变性5 min、98 ℃变性10 s、55 ℃退火10 s及72 ℃延伸90 s，合计30个循环，72 ℃延伸8 min；琼脂糖凝胶电泳鉴定所得到的PCR产物，再予以回收和纯化。

表1 PCR引物序列Tab.1 The sequences of PCR primers

1.2.2建立、鉴定和重组质粒法 采用限制性内切酶BamHI/AgeI来双酶切上一环节得到的回收纯化的PCR产物和载体质粒，然后将二者实施连接。PCR产物与载体连接的反应体系设阳性对照组(GAPDH基因的纯化PCR产物)、自连对照组(空载的质粒)及实验组(目的基因的纯化PCR产物)，将上述连接后的反应产物和感受态细胞放置在冰上30 min，90 s、42 ℃ 热激，冰水浴孵育120 s，加LB培养基500 μL，振荡37 ℃培养60 min；在培养皿上均匀涂上带有抗生素的菌液，在恒温培养箱内倒置培养12～16 h。鉴定体系配制为ddH2O和2×Taq Plus Master Mix分别吸取9.2和10.0 μL、10 μmol/L上游和下游引物均为0.4 μL，挑取单个菌落至鉴定体系中，混匀进行PCR鉴定。PCR反应条件系94 ℃预变性3 min、94 ℃变性30 s、55 ℃退火30 s 及 72 ℃延伸30 s，共22个循环，72 ℃延伸8 min。鉴定引物(在目的基因和载体上都分别有1个)运用于菌落PCR鉴定转化子(表1)。鉴定的阳性克隆转化子在LB培养基中接种，置37 ℃恒温培养箱中培养12～16 h，得定量菌液展开测序，再与目的基因序列展开对比。最后将测序无误的菌液接入LB液体培养基10 mL，置37 ℃恒温培养箱中培养，时间为12 h抽提质粒。

1.2.3鉴定包装慢病毒和感染效率 消化处于爆发式生长期的293T细胞，将细胞密度调到3.33×108/L，置于37 ℃的5%CO2培养箱中培养24 h，培养基包含1/10的血清；至细胞密度处于70%～80%时采用无血清培养基培养2 h；辅助包装质粒15 μg与GV492-Arrb2重组质粒20 μg混合均匀，用DMEM将体积调整到5 μL，室内放置5 min；将稀释后的质粒DNA溶液与加入的Lipofectamine 2000轻轻混合均匀，室内放置15 min；将质粒DNA/Lipofectamine 2000转染复合物加入到293T细胞培养液中，混合均匀后放入37 ℃的5%CO2培养箱中培养6 h；换掉培养基为包含10%血清的新细胞培养基，中途使用PBS清洗，置于37 ℃的5%CO2培养箱中培养48～72 h；收集上层透明液，4 ℃下5 500 r/min离心10 min；0.45 mm的滤器针过滤上层透明液，4 ℃下25 000 r/min离心2 h，弃上清，加病毒保存液充分溶解，10 000 r/min离心5 min，分装保存至-70 ℃环境；采用终点稀释法来测定病毒滴度，使293T细胞感染慢病毒，通过荧光显微镜鉴定Arrb2重组质粒与慢病毒是否已经顺利成功包装。

2 结果

2.1 获得和鉴定目的基因片段

琼脂糖凝胶电泳鉴定结果显示，目的基因扩增所得到的的PCR产物大小为1 274 bp，与Pubmed数据库中该基因片段大小一致，表明了引物序列和扩增体系的有效性和准确性。见图1。

图1 目的基因PCR扩增产物鉴定Fig.1 PCR amplification product identification of target genes

2.2 鉴定GV492-Arrb2重组质粒转化子

PCR和凝胶电泳鉴定结果显示(图2)，阴性对照中未见条带，排除了外源性DNA和载体对实验结果的干扰；阳性对照(GAPDH)和核酸marker说明了扩增的有效性；阳性转化子的PCR产物大小为728 bp，进一步对比Pubmed数据库中大鼠Arrb2基因序列，表明上下游引物之间基因序列大小与转化子PCR产物大小结果一致(图3)。

注：1为阴性对照(ddH2O)，2为阴性对照(空载自连对照组)，3为阳性对照(GAPDH)，4为marker，5～12为Arrb2 1～8号转化子。图2 Arrb2重组质粒转化子的鉴定结果Fig.2 Identification results of Arrb2 recombinant plasmid transformant

图3 Arrb2重组质粒测序比对结果Fig.3 Sequence alignment results of Arrb2 recombinant plasmid

2.3 病毒的滴度和感染效率

慢病毒包装完成后，采用终点稀释法测定病毒滴度为5×1011TU/L；将慢病毒与293T细胞共孵育，使慢病毒进入细胞中；荧光显微镜观察结果所示，病毒转染有效的细胞带绿色荧光，随着病毒量增加，转染细胞数逐渐增加，具有较高的感染效率。见图4。

图4 Arrb2重组慢病毒感染293T细胞(200×)Fig.4 The 293T cells infected by Arrb2 recombinant lentivirus (200×)

3 讨论

β-arrestins属于抑制蛋白arrestin家族成员，参与调节许多体内病理生理事件的发生发展，包括心血管和消化道疾病、泌尿系统和中枢神经系统紊乱等[12-13]。β-arrestins是分子量为47～55 kDa的可溶性蛋白，包含一个氨基端结构域和一个羧基端结构域，两者由极性核连接形成静止结构，当β-arrestins与受体结合后，极性核被磷酸基团干扰，构象异构，β-arrestins即被激活[2,14-16]。β-arrestins最初被认为仅仅参与G蛋白偶联受体(G protein-coupled receptors，GPCRs)的减敏以及内化[5]，而近年来的研究发现，β-arrestins作为一种支架蛋白不仅可介导GPCR信号通路，也可以招募细胞内多种信号分子并与之结合，调节其活性，进而调控细胞迁移、凋亡等过程[6,17-19]。在对Hela和HEK293细胞的研究中发现，β-arrestin2可以结合趋化因子受体4(CXC chemokine receptor 4，CXCR4)，正性调控CXCR4介导的信号通路，促进基质细胞衍生因子1(stromal cell derived factor-1，SDF-1)诱导的细胞迁移[20]。此外，有研究报道，在小鼠胚胎成纤维细胞中，β-arrestin2可以介导脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)诱导的细胞外调节蛋白激酶(extracellular regulated protein kinases，ERK)激活，上调白细胞介素-8(interleukin-8，IL-8)的表达[21]，而IL-8是调节内皮细胞及内皮祖细胞功能的重要因子[22-24]。上述结果虽证实了β-arrestin2对细胞迁移及凋亡的生物学作用，但其对内皮祖细胞的调节及在心血管疾病中的作用仍未明确，尚需要更为深入的研究。

基因修饰是目前研究基因功能的重要方法之一，通过选择适当的载体使目的基因过表达或缺失，拟研究目的基因在的实验动物或细胞模型中的作用[25]。其中，慢病毒载体是基于人类免疫缺陷型病毒发展起来的基因治疗载体，比较容易侵入分裂与非分裂细胞都，且可以实现机体内的持久表达[26-27]。慢病毒是一种自杀性病毒，中是针对目标细胞，不会侵入其他细胞，也不会利用宿主细胞滋生新兴病毒颗粒，是基因修饰的最先考虑的一个载体，现阶段，在基因靶点领域得到的普遍应用[28-29]。通过慢病毒载体系统，可以将目标基因整合至宿主细胞基因组内，获得能够稳定表达目标基因的细胞株[30-31]。本实验利用限制性内切酶消化获得线性化载体GV492，PCR扩增制备β-arrestin2目的基因片段，并进行重组反应，将线性化载体和目的基因片段体外环化，再进行转化、鉴定及抽提获取过表达慢病毒质粒。其中GV492载体的元件顺序为Ubi-MCS-3FLAG-CBh-gcGFP-IRES-puromycin，包含启动子Ubi以保证目的基因的顺利表达；3Flag标签则有利于目的蛋白表达后的检测，gcGFP为增强的绿色荧光蛋白，是在EGFP的基础上增加4个氨基酸残基突变，其荧光强度比EGFP高出60%以上，可以更好的判断重组质粒转染效率；而IRES为内部核糖体进入位点，在病毒翻译调控方面起到重要作用，puromycin使质粒具有嘌呤霉素抗性，用于筛选稳定转染的细胞。将重组质粒及病毒辅助包装质粒共转染293T细胞，成功构建GV492-Arrb2重组慢病毒，浓缩、纯化后的慢病毒滴度和传染效率都较高，为深入研究基因功能对心血管疾病的作用筑下根基。