三种方法联合检测诊断结核性胸腔积液60例临床研究*

王科文，吴胜波，马纪龙，张 宁，刘 莉△

1.解放军联勤保障部队987医院结核科(宝鸡 721006)；2.解放军陆军第946医院(伊犁 835000)；3.陕西省结核病防治院(西安 710100)

胸膜疾病最常见的临床表现是胸腔积液，据统计我国每年胸腔积液发病患者约672万，分为漏出液和渗出液。渗出性胸腔积液最常见于结核性胸腔积液(Tuberculous pleural effusion，TPE)和非TPE(主要是类肺炎性胸腔积液和恶性胸腔积液)。我国既往大样本胸腔积液数据资料显示TPE约占46.7%[1]，因胸水涂片及结核菌培养阳性率均低，胸腔镜下胸膜活检尽管阳性率高，但技术要求高，价格昂贵且为有创检查[2]，难以在广大中小型医院普及。γ-干扰素释放试验(IGRA)和结核菌核糖核酸(TB-RNA)是近年兴起的两种新的结核病辅助诊断技术，两者单一应用时存在一定局限性，二者联合胸水腺苷脱氨酶(Adenosine deaminase,ADA)可极大提高TPE的诊断准确率，且易于在临床开展。现通过回顾性分析2017年10月至2019年11月我院采用上述三种方法用于临床诊断TPE，并探讨三者联合检测在其诊断中的价值，现报告如下。

资料与方法

1 一般资料 选取2017年10月至2019年11月解放军联勤保障部队987医院结核科收治的胸腔积液患者103例。研究临床诊断为TPE患者60例，纳入TPE组，其中男49例，女11例，年龄18～79岁，平均(38.9±11.2)岁。对照组为非TPE患者43例(其中恶性胸腔积液28例，类肺炎性胸腔积液6例，其他原因9例)，全部经过胸水细胞病理学检查和(或)胸膜组织病理活检等相关辅助检查确诊。其中男35例，女8例，年龄35～81岁，平均(45.8±12.6)岁。本研究通过医院伦理审查，各组患者均知情同意并签署同意书。所有入选对象均排除HIV感染、严重肝肾功能不全、妊娠以及自身免疫性疾病。结核性胸腔积液临床诊断标准[3]：临床表现为有发热、盗汗、胸痛、乏力、气短等症状，胸部CT显示肺内无恶性肿瘤相关表现，肿瘤标志物无明显异常，胸水ADA>45 U/L，胸水细胞以淋巴细胞为主，排除其他原因引起的胸腔积液，3次胸水病理细胞学送检均未找到肿瘤细胞，抗结核治疗有效。结核性胸腔积液确诊诊断标准[4]：①胸液涂片或培养查见结核分枝杆菌；②经皮胸膜活检或胸腔镜活检病理确诊；符合上述一条以上为符合诊断标准。

2 研究方法

2.1 标本采集：两组患者均在无菌操作下经胸腔穿刺术或胸腔闭式引流术收集胸水并立即送检IGRA、胸水腺苷脱氨酶(ADA)以及胸水结核菌核糖核酸(TB-RNA)。

2.2 检测方法：IGRA检测：收集胸水约15～20 ml置入肝素锂试管，采用酶联免疫吸附实验(ELISA)检测IFN-γ，具体操作流程参考外周血IGRA，计算γ-干扰素水平，以INF-γ>60 pg/ml为阳性。胸水ADA采用连续检测法，收集胸水约10 ml离心后取上清液3 ml，检测设备为全自动生化分析仪，采用酶速率法进行检测，以胸水ADA>45 U/L定义为阳性。TB-RNA检测：取胸水标本8～10 ml，加入1～2倍体积的4%的NaOH于无菌样品管中涡旋震荡1 min以充分匀化。取液化好的胸水标本3～5 ml于样品收集管中，13000 r/min离心5 min，弃上清。加入1 ml生理盐水重悬洗涤，13000 r/min离心5 min，弃上清，加入50 μl TB稀释液重悬，该样本即为待测样本。将50 μl待测样本及50 μl已制备好的阳性对照与阴性对照超声处理15 min，取2 μl 处理物加入到含30 μl 扩增检测液的洁净微量反应管中。将微量反应管置干热恒温器上60 ℃保温10 min，取出反应管置于恒温混匀仪上42 ℃保温5 min，同时将实时荧光核酸恒温扩增技术(SAT)酶液42 ℃预热10 min，保持微量反应管于恒温混匀仪上，向微量反应管加入10 μl已预热的酶液，立即盖上管盖或贴膜振荡15 s混匀，将微量反应管转至荧光检测器，立即启动反应程序进行检测。IGRA所用检测试剂均为北京万泰生物公司提供，TB-RNA检测试剂盒由上海仁度生物科技有限公司提供，操作均按照相关说明书进行实施。

3 统计学方法 使用SPSS 22.0统计学软件对数据进行处理，计数资料的比较采用χ2检验，计算胸水IGRA、胸水ADA以及胸水TB-RNA检测的敏感度、特异度、一致性及IGRA+ADA、ADA+TB-RNA、TB-RNA+IGRA和IGRA+ADA+TB-RNA敏感度、特异度、一致性等。三种检测方法的一致性采用一致性检验，用Kappa(K)值表示，K值>0.75认为一致性好，0.4

结 果

1 不同检测方法的阳性率比较 60例诊断为TPE的患者胸水IGRA阳性率为76.67%(46/60)，胸水ADA阳性率为85.0%(51/60)，胸水TB-RNA阳性率为81.67%(49/60)，三者同时阳性者的阳性率为63.33%(38/60)；43例诊断为非TPE患者中，胸水IGRA阳性率为9.30%(4/43)，胸水ADA阳性率为11.63%(5/43)，胸水TB-RNA阳性率为6.98%(3/43)，三者同时阳性者0例。

2 三种检测方法诊断价值比较 以临床诊断为标准，胸水IGRA、ADA和TB-RNA在TPE诊断中的灵敏度分别为76.7%、85.0%、81.7%；特异度分别为90.7%、88.4%、90.7%，约登指数分别为0.674、0.734、0.724。就灵敏度而言，三种检测方法中，ADA灵敏度最高(85.0%)，IGRA最低(76.7%)；从特异度而言，IGRA(90.7%)与TB-RNA(90.7%)均高于ADA(88.4%)，ADA约登指数为(0.734)，TB-RNA次之(0.724)，IGRA最低(0.674)。各检测方法与临床诊断结果比较差异均有统计学意义(P<0.001)，见表1。

表1 三种检测方法诊断价值比较

3 三种检测方法联合对TPE诊断价值比较 采用两种及两种以上检测方法联合进行诊断，以临床诊断为标准，IGRA+ADA、ADA+TB-RNA、TB-RNA+IGRA和IGRA+ADA+TB-RNA灵敏度分别为91.7%、95.0%、90.0%、96.7%；特异度分别为81.4%、79.1%、83.7%、74.4%，约登指数分别为0.731、0.741、0.737、0.711。其中IGRA+ADA+TB-RNA灵敏度最高(96.7%)，TB-RNA+IGRA灵敏度最低(90.0%)，TB-RNA+IGRA特异度最高(83.7%)，IGRA+ADA+TB-RNA特异度最低(74.4%)，ADA+TB-RNA约登指数最高(0.741)，IGRA+ADA+TB-RNA约登指数最低(0.711)。IGRA、ADA、TB-RNA三种方法的联合检测与临床诊断结果比较差异均有统计学意义(P<0.001)，见表2。

表2 三种检测方法联合对TPE诊断价值比较

讨 论

TPE是由于结核杆菌及其自溶、代谢产物进入超敏感机体胸膜腔，导致胸膜产生高度变态反应而发生的胸膜炎症[5]。由于胸膜腔的无菌性特征，故胸水涂片和胸水结核菌培养阳性率均偏低，而胸腔镜下胸膜活检尽管阳性率高，但存在技术操作较复杂、价格昂贵以及为有创等缺点，难以在广大中小型医院开展，故长期以来TPE的诊断主要靠多种检查手段综合分析判定。IGRA检测原理是在结核分枝杆菌(MTB)感染患者外周血或感染部位体液中会产生记忆T淋巴细胞并长期在人体内存在，当再次受到MTB相关抗原刺激后会迅速增殖成为效应T淋巴细胞并分泌γ-干扰素[4-5]，通过测定T细胞γ-干扰素释放反应可用来检查患者是否受到MTB感染[6]。目前在应用外周血或胸水作为IGRA标本选择上尚存在一定争议，多数学者倾向于采用外周血IGRA诊断TPE，且获得了较高的诊断敏感度和特异度。Ates等[7]研究发现采用胸水IGRA诊断TPE准确性较差，但Liu等[8]发现采用胸水或者外周血IGRA诊断TPE，二者灵敏度均可达到90%以上，与刘慧梅等[9]研究结果一致。而周敏等[10]研究结果表明，与外周血IGRA比较，胸腔积液IGRA可能对TPE诊断价值更高。刘亚亚等[4]研究显示胸水IGRA单独诊断TPE时其灵敏度、特异度分别为96.38%、29.31%，而联合ADA诊断TPE时其灵敏度、特异度分别为81.88%、98.28%。本研究结果显示胸水IGRA诊断TPE灵敏度、特异度分别为76.67%、90.70%，与上述研究结果存在一定差异，考虑与所选样本量较小有关。本研究结果显示采用联合检测后灵敏度较单项检测均有明显提高，IGRA+ADA+TB-RNA三者联合时灵敏度最高为96.7%，更有利于TPE诊断。胸腔积液γ-干扰素水平增高有助于TPE的诊断，研究显示胸腔积液γ-干扰素水平>3.7 U/ml TPE的诊断敏感性和特异性均可达到98%以上，明显高于胸腔积液结核菌涂片和培养阳性率，但脓胸患者胸腔积液γ-干扰素水平亦可增高[1]，故需要在临床上进一步鉴别。

ADA是T淋巴细胞的一种重要的酶，其广泛存在于全身组织中，其功能为催化腺苷脱氨生成肌酐，与细胞免疫活性有关。ADA活性增高与T淋巴细胞的激活、增值、分化有关。TPE患者因细胞免疫受刺激，淋巴细胞明显增多，故ADA在TPE中的含量较恶性胸腔积液及右心功能不全引起的胸腔积液均显著增高，表明胸腔积液ADA测定对上述胸腔积液的鉴别有重要意义[11]。既往关于ADA诊断TPE荟萃分析显示：ADA在TPE诊断中具有较高的价值，也可作为TPE的诊断标准[12-13]。目前国内多以ADA(>45 U/L)作为诊断TPE的临界值，胸腔积液ADA/血清ADA>1也是目前诊断TPE的常用指标之一。大量研究显示ADA在TPE的诊断上具有较高的准确度、敏感度和特异度，但检测结果也存在假阴性或假阳性的问题，文献报道ADA有时存在诊断的敏感度和特异度偏低的情况，敏感度低多考虑与机体免疫功能减退(如感染人免疫缺陷病毒)或炎症早期有关[13]。但值得注意的是：胸腔积液ADA水平升高也可出现在肺炎旁胸腔积液、类风湿性疾病所致胸腔积液、肺吸虫病以及大多数脓胸患者中，此外在一些较为罕见的疾病如Q热和布鲁斯杆菌病患者中亦可表现为增高[14]，故在上述疾病中特异度较低。本研究结果表明ADA在TPE诊断中具有较高的特异度(88.37%)。大量研究表明以>45 U/L为界，其诊断TPE总的准确度可达到99.2%、敏感度为100%、特异度为98.6%[11]，与本研究结果存在一定偏差，考虑与所选样本量较小有关。此外，研究表明胸腔积液ADA数值与TPE诊断呈正相关，即胸腔积液ADA水平越高，患TPE可能性越大[15-16]。

实时荧光核酸恒温扩增技术(SAT)是基于PCR发展起来的一种核酸序列扩增的新技术，以病原体RNA为检测模板，具有高度的敏感性和特异性[11]，无需温度循环，反应速度快，扩增效率高。另外因SAT不需要经过高温变性步骤，即使在有背景DNA的存在亦不会受到影响，故其检测敏感性和准确性均明显高于其他分子检测技术。Cui等[17]采用SAT技术检测MTB，灵敏度可达到100 CFU/ml，在菌阴患者标本中阳性率39.2%，结果与临床诊断一致。林忠惠等[18]研究发现胸水TB-RNA在TPE诊断上具有较高的灵敏度和特异度，与本研究结果基本一致。因RNA只存在于活的结核分枝杆菌内，故TB-RNA检测技术亦可用于活动性肺结核的诊断和治疗效果的监测，尤其对菌阴肺结核具有更高的临床诊断价值[19-20]。此外SAT技术可辅助判断抗结核治疗的效果，罗贤等[21]采用SAT技术快速检测治疗前后痰标本中的MTB，发现其对痰中结核杆菌具有较高的灵敏度，可用于肺结核早期诊断和治疗疗效的判断，并可为治疗方案的早期调整提供参考。但目前在应用基因检测技术诊断肺外结核病时尚存在标本处理不当、操作方法不规范、技术不过关、扩增系统操作较复杂等技术方面问题，存在假阳性，进而间接造成检测结果出现误差[22]。

崔魁丽等[23]研究发现，TPE特别是合并有明显胸腔积液的患者，其体内γ-干扰素、ADA表达水平明显高于非结核组。本研究结果显示联合应用上述三种检测技术，可以进一步提高临床诊断TPE的灵敏度，降低漏诊率，值得推广使用。