吉马酮对宫颈癌Hela细胞增殖、迁移、侵袭和凋亡作用的研究

李 艳，周露秋，任黔川

0 引言

宫颈癌(Cervical cancer，CC)是危害女性健康的主要恶性肿瘤之一，其发病率和死亡率在全世界女性恶性肿瘤中居第4位[1]。近年来，虽然我国宫颈癌整体死亡率在宫颈癌普查和人乳头瘤病毒(Human papillomavirus，HPV)疫苗的积极推广下有所下降，但城市妇女死亡率仍呈持续上升趋势[2-3]，给宫颈癌的治疗带来巨大挑战。目前，越来越多的研究发现，中草药在宫颈癌的治疗中发挥着积极作用[4-6]。吉马酮(Germacrone)作为中草药姜黄提取物中的主要生物活性成分之一，具有广泛的药理作用，如抗肿瘤、抗氧化、抗炎等[7-13]，但吉马酮在宫颈癌中的作用国内外尚无报道。本实验拟探讨吉马酮对人宫颈癌Hela细胞的作用及其机制，为宫颈癌药物研发提供相关理论依据。

1 材料和方法

1.1 试剂与仪器 吉马酮(Solarbio，批号：423B0-22)；MEM培养基(Procell，批号：WH01111905XP)；青链霉素双抗(Hyclone，批号：J180034)；胎牛血清(CLARK，批号：JC63468)；CCK-8试剂盒(Beyotime，批号：68121000);Transwell小室(Corning，批号：05619049)；人工基底膜Matrigal(Corning，批号：9056014)；Annexin V-APC/PI试剂盒(批号：20190809)与细胞周期检测试剂盒(批号：20190805)均购自KeyGEN bioTECH公司；Bax抗体(Abcam，批号：ab32503)；Bcl-2抗体(Affinity,批号：AF6139)。倒置相差显微镜(日本Olympus公司)；流式细胞仪(美国BD公司)；台式高速冷冻离心机(上海卢湘仪仪器厂)；Western blot电泳仪(北京市六一仪器厂)等。

1.2 细胞株 人宫颈癌Hela细胞株(西南医科大学中心实验室)。

1.3 方法

1.3.1 药物配置 将11 mg吉马酮溶于500 μl的二甲基亚砜(DMSO)中，制备成100 mmol/L的母液，置于-20 ℃保存备用。

1.3.2 细胞培养 将 Hela细胞培养于MEM培养液(青霉素100 U/ml、链霉素 100 μg/ml、10%胎牛血清)中，置于37 ℃、5% CO2培养箱中培养，当细胞生长密度为80%～90%时，按1∶3传代培养。

1.3.3 CCK-8检测细胞增殖 取对数生长期Hela细胞，加入培养基制备单细胞悬液，调节细胞密度4×104/ml，100 μl/孔接种于96孔板中，每组设置3个复孔，于37 ℃、5% CO2恒温中培养，待细胞贴壁后，加入不同浓度的吉马酮(0、40、80、120、160、200、240、280 μmol/L)；待药物分别作用24 h、48 h、72 h后，向每孔中分别加入10 μl CCK-8溶液，轻轻敲击培养板混匀，培养箱中孵育3 h后，置于酶标仪，测定其在450 nm处的吸光度值(OD值)，并计算生长抑制率。

1.3.4 Transwell检测细胞迁移 取对数生长期Hela细胞，加入培养基制备单细胞悬液，调节细胞密度1×105/ml，2 ml/孔接种于6孔板中，每组设置3个复孔；各组分别加入不同浓度的吉马酮(0、120、180、240 μmol/L)处理24 h，消化清洗后用无血清培养基重悬细胞，调节细胞密度2.5×105/ml，200 μl/孔接种于Transwell上室中，600 μl含10%血清的培养基加入Transwell下室，37 ℃、5% CO2恒温培养12 h，PBS洗涤后加入100%乙醇固定30 min，0.1%结晶紫染色30 min，PBS洗去多余结晶紫，湿润棉签擦拭上室面的滤膜后，对小室外侧的细胞进行拍照；加入33%醋酸进行溶解，再置于酶标仪测定其在570 nm处的OD值。

1.3.5 Transwell检测细胞侵袭 将Matrigel基质胶从-20 ℃冰箱中取出，并置于4 ℃冰箱过夜融化，在冰上将Matrigel与无血清培养基以1∶8的比例稀释，吸取100 μl加入Transwell的上室底部，放置于培养箱中孵育4 h，加入100 μl无血清培养基水化30 min。取出6孔板，其余步骤同“1.3.4”项，置于倒置显微镜下拍照(100×)、计数，计数时在同一倍镜选取6个不同视野，取平均值。

1.3.6 Annexin V-APC/PI双染检测细胞凋亡 取对数生长期Hela细胞，加入适量培养基制备单细胞悬液，调节细胞密度1×105/ml，2 ml/孔接种于6孔板中，每组设置3个复孔，于37 ℃、5% CO2恒温中培养，待细胞贴壁后，依次加入不同浓度的吉马酮(0、120、180、240 μmol/L)干预24 h。消化收集细胞后，1 000 r/min离心5 min，PBS洗涤离心细胞2次，用500 μl的Binding Buffer重悬细胞，加入5 μl Annexin V-APC混匀后，再加入5 μl的PI混匀；室温避光10 min，应用流式细胞仪检测细胞凋亡。

1.3.7 PI单染法检测细胞周期 药物干预步骤同“1.3.5”项；干预24 h后洗涤消化收集细胞，缓慢加入-20 ℃预冷的75%的冷乙醇，重悬细胞，4 ℃固定过夜；3 000 r/min离心5 min，PBS洗涤2次，加入配制好的500 μl PI/RNase A染色工作液(现配现用。将Rnase A∶PI工作液按1∶9体积配制)，室温避光30 min后，置流式细胞仪检测,用CytExpert分析软件进行细胞周期分析。

1.3.8 Western blot检测Bax、Bcl-2蛋白 不同浓度吉马酮培养细胞24 h，收集并裂解细胞提取总蛋白，采用BCA法测定蛋白浓度，定量，变性；每孔加入40 μg蛋白进行电泳分离；将蛋白转至PVDF膜，加入封闭液室温摇床封闭2 h；洗膜后加入一抗β-catenin(1∶100 000)、Bax(1∶2 000)、Bcl-2(1∶500)，4 ℃孵育过夜；PBST洗膜后加入稀释后(1∶5 000)的二抗，室温孵育2 h；最后加入适量ECL发光液后于凝胶成像仪曝光拍照并统计灰度值，计算相对表达量。

2 结果

2.1 吉马酮对Hela细胞增殖的影响 CCK-8实验结果提示，不同浓度吉马酮(0、40、80、120、160、200、240、280 μmol/L)作用宫颈癌Hela细胞24、48、72 h后，细胞生长抑制率情况见图1，与空白对照组(细胞生长抑制率为0)相比，在相同浓度下，培养时间越长，细胞增殖抑制率差别不大，不具有时间依赖性(P>0.05)；在同样培养时间下，随着药物浓度升高，细胞的生长抑制率增强，呈现浓度依赖性(P<0.05)。24 h的IC50=182.09 μmol/L。

2.2 吉马酮对Hela细胞迁移和侵袭的影响 经不同浓度的吉马酮(0、120、180、240 μmol/L)处理Hela细胞24 h后，迁移实验结果如图2所示，随着吉马酮浓度的增加，其OD值减小(P<0.01)；侵袭实验结果如图3所示，随着吉马酮浓度的增加，穿过小室的细胞数量明显减少，呈浓度依赖性(P<0.01)。上述结果说明，吉马酮可以明显减弱宫颈癌Hela细胞的迁移及侵袭能力。

图1 不同浓度吉马酮对Hela细胞增殖能力的影响(n=3)

2.3 吉马酮对Hela细胞凋亡能力的影响 经不同浓度的吉马酮(0、120、180、240 μmol/L)处理Hela细胞24 h后，Annexin V-APC/PI双染检测细胞凋亡，结果如图4所示，随着药物浓度的增加，总凋亡率明显增加，且与对照组相比差异有统计学意义(P<0.01)，提示吉马酮可以呈剂量依赖性诱导Hela细胞凋亡。见表1。

2.4 吉马酮对Hela细胞凋亡周期的影响 用不同浓度吉马酮(0、120、180、240 μmol/L)处理Hela细胞24 h后，流式细胞仪检测结果提示，随着药物浓度的增大，处于G1、G2期细胞减少，S期细胞随着药物浓度的增大而增加，且与对照组相比差异具有统计学意义(P<0.01)，提示给药后的Hela细胞凋亡周期可被阻滞于S期。见图5。

图2 吉马酮对Hela细胞迁移的影响(n=3)

图3 吉马酮对Hela细胞侵袭的影响(n=3)

表1 不同浓度吉马酮对Hela细胞凋亡率的影响(n=3)

图4 吉马酮对Hela细胞凋亡的影响(n=3)

图5 不同浓度吉马酮对Hela细胞周期分布的影响(n=3)

2.5 吉马酮对Bcl-2、Bax表达的影响 用不同浓度吉马酮(0、120、180、240 μmol/L)处理Hela细胞24 h后，通过蛋白印迹检测细胞内Bax、Bcl-2蛋白表达水平，见图5。结果显示，在180 μmol/L和240 μmol/L吉马酮药物作用下，Bax蛋白与对照组相比差异具有统计学意义(P<0.05)，且随着药物浓度增加，Bax蛋白相对表达增加。同时，吉马酮以浓度依赖的方式下调Bcl-2蛋白的表达，差异具有统计学意义(P<0.01)，见图6。

3 讨论

近年来，中草药在抗宫颈癌新药研究和治疗中备受关注[14-15]。吉马酮在多种肿瘤细胞中具有抗肿瘤活性，如可抑制肺癌NCI-H460细胞的增殖[16]。张淑琴等[8]研究发现，吉马酮对肝癌HepG2细胞增殖有抑制作用。本研究CCK-8实验结果提示，吉马酮对宫颈癌Hela细胞的抑制作用随浓度增加而增强，呈浓度依赖性，提示吉马酮可抑制宫颈癌Hela细胞增殖。

图6 吉马酮对Hela细胞的Bax、Bcl-2蛋白表达的影响(n=3)

研究发现，吉马酮抑制肝癌HepG2细胞增殖的机制可能与阻滞G2/M期细胞周期相关[8]，此外，体外研究结果表明吉马酮可诱导胶质瘤细胞周期发生的G1期阻滞[10]。本研究发现，吉马酮可以诱导宫颈癌Hela细胞发生S期细胞周期阻滞，使其无法进入正常细胞周期，从而抑制其增殖。

研究表明，有多种天然化合物可促进宫颈癌细胞凋亡[17-19]。本研究结果表明，吉马酮可诱导Hela细胞凋亡，且凋亡率随着药物浓度的增加而增加，呈现出一定的浓度依赖性，证实吉马酮对宫颈癌Hela细胞的增殖具有抑制作用，其机制可能与诱导细胞凋亡相关。

研究表明，凋亡蛋白抑制家族、Bcl-2家族等一系列基因激活、调控及表达等在细胞凋亡过程中发挥着重要作用[19-20]。其中,Bcl-2家族包括抗凋亡蛋白(如Bcl-2、Bcl-xl等)和促凋亡蛋白(Bax、Bok等)是近年来细胞凋亡研究的热点蛋白，主要参与调节线粒体凋亡途径[21]。Bcl-2具有稳定线粒体膜并抑制细胞色素C释放的抗凋亡功能，Bax是Bcl-2蛋白活性的关键调节因子，可激活凋亡蛋白结合位点，从而导致细胞凋亡，Bcl-2/Bax比例可以反映细胞凋亡的情况[22]。本研究结果表明，吉马酮可以浓度依赖性下调Bcl-2蛋白和上调Bax蛋白，进一步证实了吉马酮促进细胞凋亡可能与下调Bcl-2/Bax蛋白表达有关。

细胞侵袭和迁移在癌细胞发生局部复发和远处转移过程中发挥着至关重要的作用，研究表明，中草药可以削弱宫颈癌Hela细胞的侵袭迁移能力[4-5]。Lim等[13]研究发现，吉马酮对乳腺癌细胞的迁移有抑制作用。李冰等[7]研究表明，吉马酮可以通过降低VEGF的表达，进一步抑制人非小细胞肺癌NCI-H1770的侵袭迁移能力。本研究结果提示，吉马酮以浓度依赖性方式抑制宫颈癌Hela细胞的侵袭及迁移能力。

综上所述，吉马酮可抑制宫颈癌Hela细胞增殖、侵袭、迁移能力和诱导发生S期周期阻滞，且可通过下调Bcl-2/Bax蛋白的表达促进Hela细胞凋亡。本研究从细胞和分子水平初步探讨吉马酮对宫颈癌Hela细胞的影响，探索其发挥药物作用的物质基础和作用机制，为临床治疗宫颈癌提供了实验基础和理论依据。