水貂皮肤黑色素细胞体外分离、培养及初步鉴定

张如，宋兴超，杨童奥，宋姗姗，丛波，郑军军，王桂武，刘琳玲※

（1.中国农业科学院特产研究所，吉林 长春 130012；2.铜仁学院，贵州 铜仁 554300）

水貂是一种珍贵的毛皮动物，是世界裘皮产业三大支柱之一[1]。目前，我国人工饲养的水貂主要有红眼白水貂、银蓝水貂、咖啡水貂和短毛黑水貂等[2]。随着毛皮服装、服饰产品类型的不断增加，消费者对皮毛颜色的要求也越来越高。尽管我国是水貂等特种畜禽养殖大国，但毛色等级与国外还存在一定的差距，毛色等级亟需提高[3]。近年来，从国外引进的水貂品种由于饲养环境和饲料等因素的变化，也逐渐出现了毛色等级下降的现象。因此，提高毛色等级以及研究调控水貂毛色的手段与方法，已成为目前水貂毛色研究的重中之重。

黑色素细胞（melanocyte cell, MC）是合成黑色素的细胞，主要存在于脊椎动物的毛囊、表皮及真皮的基底层，约占基底层细胞的 10%[4]。Sangiovanni 等[5]首次描述了黑色素细胞的形态及结构，并且表明MC 与皮肤色素沉着存在较为密切的关系。因此，MC 将是深入明确毛色基因调控功能的重要生物模型。研究证实，3,4-二羟苯丙氨酸（dihydroxyphenylalanine,Dopa）是MC 内酪氨酸酶的特异性作用底物，Dopa 染色可作为初步形态学鉴定MC 存在的一种重要手段[6]。如何取材简便且能保存完整遗传信息、具备良好的细胞活性是研究MC 的关键。目前，MC 研究较广泛，主要通过采集皮肤组织，已成功获得猪[7]、兔[8]、乌骨鸡[9]和羊驼[10]等脊椎动物的黑色素细胞，但对于特种动物——水貂黑色素细胞的相关研究鲜见报道。本研究拟探索水貂皮肤黑色素细胞分离、培养条件，建立体外细胞培养方法，初步对体外培养的水貂皮肤黑色素细胞进行形态学鉴定，为进一步建立水貂黑色素细胞系提供科学依据，可为今后水貂毛色基因功能研究提供理想的生物学细胞模型。

1 材料与方法

1.1 样品采集

用手动电推将换毛期水貂背部被毛刮净，75%乙醇消毒，采集换毛期水貂背部皮肤组织（1.0 cm 0.2 cm），利用含有双抗的PBS 缓冲液冲洗3～5 次，3～5 min/次，将皮肤组织放入含有双抗的 DMEM 培养基中带回实验室。

1.2 主要试剂与仪器

胎牛血清（FBS）、DMEM培养基（Corning）、DMEM/F12 培养基（Corning）、M-254 培养基（Gibco）、0.25%胰蛋白酶、青霉素-链霉素（Gibco）、DispaseⅡ（Gibco）、胶原酶Ⅰ（Gibco）、磷酸盐缓冲液（phosphate buffer saline, PBS）、多巴染色液（Gibco）、4% 的组织细胞固定液（北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司）；荧光显微镜（Olympus）、CO2 恒温培养箱（Thermo）、台式低速离心机（湖南赫西仪器装备有限公司）。

1.3 细胞分离与培养

1.3.1 黑色素细胞原代分离、培养 参考羊驼和小鼠黑色素细胞分离方法[11-12]，用眼科镊和手术刀将表皮多余毛刮掉，去掉多余脂肪组织，用75% 乙醇清洗3 次，3 min/次，PBS冲洗 3 次。在显微镜下将表皮与真皮剥离，用含有双抗的PBS 清洗 3 次，5 min/次，再将表皮组织剪成0.2 cm 0.1 cm，PBS 清洗后，经0.25%DispaseⅡ于4 ℃ 冰箱过夜消化。将组织取出于操作台内，终止消化，用 PBS 洗 2～3 次 ，5 min/次；将组织块剪碎于0.1%胶原酶Ⅰ中，37 ℃孵育2 h。终止消化，收集滤液，1 000 r/min 离心5 min，用培养液清洗2～3次后转移至培养瓶内，放于37 ℃ CO2 培养箱中进行培养，2 d 换液 1 次。

1.3.2 不同培养基培养黑色素细胞 分别使用含有10%的胎牛血清以及含100 U/mL 青霉素和100 g/mL链霉素的DMEM 培养基和DMEM/F12 培养基，含有1% 的生长因子、100 U/mL 青霉素和100 g/mL 链霉素的M-254 培养基，于37 ℃CO2 培养箱内培养水貂黑色素细胞。

1.3.3 黑色素细胞传代培养 当原代黑色素细胞生长至80%～90%时，将培养基吸出，加入0.25% 的胰蛋白酶进行消化，2 min 后即可看到有细胞变圆、脱落，终止消化，吹落细胞，收集消化液，1 000 r/min 离心5 min，加入培养液重悬细胞进行传代。经过4 次传代纯化培养后，基本可以得到较纯的黑色素细胞[13]。

1.3.4 黑色素细胞冷冻保存及复苏 取第4 代生长融合至80%～90% 的黑色素细胞，加入0.25%的胰蛋白酶进行消化，终止消化，收集消化液，1 000 r/min 离心5 min[14]。利用提前配制好的细胞冻存液重悬细胞，细胞冻存液FBS 与DMSO 的体积比为 9∶1，细胞密度为1 106个/mL，分装于无菌冻存管保存。冻存管依次放 4 ℃ 30 min，﹣20 ℃ 2 h，﹣ 80 ℃ 过夜，最后转入液氮长期保存。冻存30 d 后，取出1 管水貂黑色素细胞，迅速将其放入37 ℃水浴锅中融化，融化时间控制在30 min 内。离心，弃冻存液，加入M-254 培养基重悬于培养瓶培养。为避免DMSO 对黑色素细胞的影响，可在24 h 后换液1 次。

1.4 Dopa 染色鉴定

取第4 代对数生长期的水貂黑色素细胞，接种至6 孔板中，6 孔板内提前放入载玻片。细胞爬片，融合度达 80% 后，吸弃 M-254 培养液，PBS 洗 3 次，每次5 min；加入适量4% 多聚甲醛固定细胞30 min，吸弃固定液，PBS洗3次，每次5 min；加入0.3%Tritonx-100通透 30 min，PBS 再洗 3 次，5 min/次；加入 0.1% LDopa 染色液，放入37 ℃ 培养箱孵育4 h，中间换液1 次；PBS 冲洗，显微镜观察。

2 结果与分析

2.1 水貂皮肤黑色素细胞形态学观察

通过倒置显微镜观察培养不同阶段水貂黑色素细胞的细胞形态。由图1 可知，所分离水貂黑色素细胞在48 h 贴壁生长，能观察到两极或三极树突状的细胞贴壁。连续培养21d后，M-254培养的细胞融合可达80%，经传代培养，细胞平铺呈典型的细长梭形，经过多次传代培养纯化细胞，传代后的细胞2～3 d 即可长满培养瓶瓶底，可进行连续传代。而DMEM、DMEM/F12 培养基所培养水貂黑色素细胞易发生突变且生长极其缓慢。

图 1 水貂黑色素细胞形态Fig. 1 Melanocyte morphology of mink

2.2 水貂皮肤黑色素细胞Dopa染色鉴定

Dopa染色原理是酪氨酸酶与底物多巴进行反应，细胞呈棕黑色。该研究选取第4 代的水貂皮肤黑色素细胞进行Dopa 染色，结果如图2 所示，分离培养的黑色素细胞呈棕黑色阳性，形态学初步鉴定为水貂黑色素细胞。

图 2 水貂黑色素细胞多巴染色鉴定Fig. 2 Identification of mink melanocytes by Dopa staining

3 讨论

目前，皮肤组织的选取是分离培养黑色素细胞的关键。研究表明，利用0.25% 胰蛋白酶消化人包皮组织成功分离出黑色素细胞，培养14d 后即可长满[15-16]。Bai等[17]利用0.2% Dispase Ⅱ和0.25% 胰蛋白酶（含0.02% EDTA）两步法分离羊驼黑色素细胞，分离纯度得到提高，缩短了整个试验的操作时间，减少了对细胞的伤害。樊蕊蕊[4]利用0.25% Dispase Ⅱ、0.1% 胶原酶Ⅰ及0.25%胰蛋白酶（含0.02%EDTA）三步法分离小鼠皮肤毛囊源性黑色素细胞，分离纯度高且分离得到细胞中杂细胞少。迄今为止，鲜见水貂皮肤黑色素细胞体外分离培养的相关报道。宋兴超等[18]利用Dopa染色对水貂黑色素细胞研究结果表明，皮肤黑色素细胞主要分布于水貂有色被毛的表皮、毛囊外根鞘、毛囊顶端及毛根髓质层。该研究选取水貂皮肤组织分离表皮MC，经优化条件后培养7 d 即可获得较多的黑色素细胞。在细胞消化方法方面，主要比较了2 种不同的方法，第1 种：0.25%Dispase Ⅱ联合0.25%胰蛋白酶（含0.02% EDTA），消化时间长，对细胞造成伤害较大，且分离出细胞较少；第2 种：0.25%DispaseⅡ、0.1%胶原酶Ⅰ及0.25%胰蛋白酶（含0.02%EDTA）联合消化分离出的细胞较多，并且培养效果好。综合考虑，0.25%DispaseⅡ、0.1%胶原酶Ⅰ联合0.25%胰蛋白酶可以作为水貂皮肤黑色素细胞分离的最佳方法。

培养原代黑色素细胞对于培养基的要求较为严格，选择合适的培养基是成功培养黑色素细胞的关键。该研究参考樊蕊蕊等[6]、Godwin等[13]和Bai等[17]培养原代黑色素细胞选用不同培养基的方法，以DMEM、DMEM/F12 和 M-254（含 HMGS 无血清）作为 3 种候选培养基。结果表明，DMEM和DMEM/F12 培养的原代黑色素细胞传至第4 代时，细胞出现分化现象，形态似“太阳”，且生长缓慢；M-254 黑色素细胞专门培养基在添加生长因子情况下，生长速度快且细胞增殖周期缩短，传至4 代后形态一致且生长状态较好。

本研究通过控制消化时间，成功分离出水貂皮肤黑色素细胞，经传代纯化后发现体外培养的黑色素细胞与体内组织观察到的形态一致，均具有树突样突起。黑色素细胞内的酪氨酸酶具有氧化多巴形成黑色物质的特性，对所培养的水貂皮肤黑色素细胞进行Dopa染色，结果呈黑色阳性，并且具有黑色素细胞所特有的突起，这与乌骨鸡[9]和羊驼[17]等黑色素细胞形态学染色鉴定结果基本一致。

综上所述，本研究通过选取水貂皮肤组织和专用培养基，利用消化时间的差异，在体外成功分离出水貂黑色素细胞，经形态学观察和Dopa 染色检测初步鉴定所分离的细胞为水貂皮肤黑色素细胞，为进一步研究水貂黑色素细胞的生物学特性提供了基础试验数据，同时也为深入研究水貂黑色素细胞在毛色形成过程中的功能调控奠定了科学依据。