霉菌毒素引起狐狸流产的实验室诊断及防控措施

乔连江，张萍，金春彬，杨艳玲※

（1.中国农业科学院特产研究所，吉林 长春 130112；2.通化农业学校，吉林 通化 134000）

狐狸流产是人工饲养条件下一种常见的生殖系统疾病，引起流产的原因很多，包括细菌、病毒和寄生虫等病原微生物引起的传染性因素以及应激、营养不良和机械损伤等引起的非传染性因素[1-3]。霉菌毒素作为一类真菌代谢的有毒物质，主要存在于谷物、坚果、棉籽及一些与动物饲料相关的产品中[4-5]。当狐狸采食被霉菌毒素污染的饲料时，就会出现中毒症状，轻则引起食欲减退、繁殖障碍、免疫力下降，继发多种疾病等，重则引起狐狸的直接死亡。

霉菌毒素是谷物或饲料中霉菌生长产生的有毒代谢产物，其造成的危害是一个全球性的问题[6]。目前，已知的霉菌毒素有300 多种，常见的有黄曲霉毒素、玉米赤霉烯酮、T-2 毒素、赭曲毒素和伏马毒素等。其中，黄曲霉毒素在临床上多表现为生长缓慢、肝脏损伤、流产及免疫抑制等；玉米赤霉烯酮是一种具有雌性激素类物质活性的毒素，可造成母畜假怀孕、不发情和持续性不孕等；T-2 毒素作为毒性高的免疫抑制物质，可破坏淋巴系统，危害生殖系统等；赭曲毒素主要由曲霉菌产生，临床上多表现为高毒性，可致癌；伏马毒素可对某些家畜产生急性毒性及潜在的致癌性[7-11]。

近年来，霉菌毒素引起的狐狸流产病例时有发生，尤其在最近几年呈上升趋势，严重影响我国毛皮动物的健康养殖，给养殖户带来了严重的经济损失。目前，已发现牛、猪、羊和兔等动物均可因食入霉菌毒素污染的饲料而引起繁殖障碍疾病，且该病尚未发现特效药[12-13]，给动物规模化养殖带来了巨大损失。为了引起养殖户对黄曲霉毒素的重视，并了解其危害，本研究对吉林省某狐狸养殖场发生的不明原因流产病例，进行了临床剖检、病变组织和器官诊查并开展了实验室检测，以期确定引起狐狸流产的病因，为近年来发病率逐渐增加的狐狸流产防控提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 病料来源

吉林省某规模化狐狸养殖场中240 只妊娠母狐，配种后45～60 日龄开始流产、产死胎和弱胎。目前，已经流产或产死胎及弱胎共150 窝。

1.2 病料采集

现场观察发病狐狸的情况，并调查病狐采食饲料的组成和来源。无菌采集流产狐狸的血液、肝脏、脾脏、肾脏、子宫体、肠系膜淋巴结及流产胎儿等组织，并对其进行标号，冷藏保存。

1.3 主要试剂

布鲁氏菌虎红平板凝集试验抗原（中国兽医药品监察所）；黄曲霉毒素总量ELISA检测试剂盒、玉米赤霉烯酮ELISA 检测试剂盒、T-2 毒素ELISA 检测试剂盒、呕吐毒素ELISA检测试剂盒和伏马毒素ELISA检测试剂盒（江苏省苏微微生物研究有限公司）；TSA 固体培养基（Sigma 公司）；DNA/RNA 提取试剂盒（TakaRa 公司）。

1.4 主要仪器

酶标仪（BioTek公司）；恒温恒湿培养箱（MEMMERT 公司）；PCR 扩增仪（美国 Bio-Rad 公司）。

1.5 病理剖检

对流产狐狸进行解剖，诊查各个脏器的变化，判定病理变化的部位、程度及其性质，并采集病变脏器作为实验室诊断的样本。

1.6 布鲁氏菌病检测

为了确定引起狐狸流产的病因是否是由于布鲁氏菌感染而引起的，利用布鲁氏菌虎红平板凝集试验对采集的流产母狐血清样品进行了检测，具体操作流程参照虎红平板凝集试验说明书进行。布鲁氏菌病阴、阳性的判定标准为是否出现肉眼可见的凝集。

1.7 细菌培养

为了进一步明确引起此次流产的病原是否是加德纳氏菌等病原微生物，在无菌条件下，对流产狐狸子宫及流产胎儿肝脏进行细菌分离、培养试验。严格按照无菌操作原则处理取回的脏器，分别取少许将其均匀涂布于TSA培养基上，倒置于37 ℃恒温培养箱中培养，观察有无细菌生长。

1.8 病毒检测

1.8.1 病料处理 由于狐狸肝脏黄染、变性坏死，因此进一步对流产狐狸进行犬腺病毒检测。将采集的狐狸脏器经液氮研磨后，与无菌ddH2O 充分混匀，取1.2 mL 置于 1.5 mL EP 管中，6 000 r/min、4 ℃下离心 5 min，取上清经0.22m 滤膜过滤后备用。采集血液样品，取 1.2 mL 置于 1.5 mL EP 管中，6 000 r/min 下离心5 min，取上清经0.22m 滤膜过滤后备用。

1.8.2 DNA 提取 取“1.8.1”中的滤液200L，利用TaKaRa 公司生产的DNA/RNA 提取试剂盒进行核酸提取，﹣20 ℃下保存。

1.8.3 PCR 检测 根据参考文献[14]中检测犬腺病毒（canine adenovirus，CAV）的方法，对采集样品进行PCR检测，PCR产物用1%琼脂糖凝胶进行电泳，观察电泳结果。

1.9 真菌毒素ELISA检测

为了确定狐狸流产是否由霉菌毒素中毒引起，分别对临床上采集的流产狐狸病料进行了黄曲霉毒素总量、伏马毒素、T-2 毒素、赭曲霉素和玉米赤霉烯酮5 种霉菌毒素的检测。检测方法参照江苏省苏微微生物研究有限公司真菌毒素 ELISA 检测试剂盒说明书进行操作。

2 结果与分析

2.1 剖检变化

通过对流产狐狸进行剖检，剖检结果显示狐狸肝脏出现黄染、坏死、质脆和肿胀（图1 A），胆汁淤积（图1 B），肠系膜淋巴结肿胀、坏死（图1 C），胃穿孔（图1 D），肺脏苍白（图 1 E），产死胎或弱胎（图 1 F）。

图1 流产狐狸临床解剖及各脏器病理变化Fig.1 The clinical anatomy of aborted fox and the pathological changes of various organs

2.2 布鲁氏菌病虎红平板凝集试验结果

对流产狐狸的血清进行虎红平板凝集试验（图2），结果显示流产狐狸血清未与布鲁氏菌诊断抗原发生凝集现象。因此，可以排除此次狐狸流产是由布鲁氏菌病感染而引起的。

图2 虎红平板凝集试验结果Fig.2 The results of RBPT

2.3 细菌培养

对流产狐狸、流产胎儿肝脏及子宫内容物进行细菌分离与鉴定，结果显示在TSA培养基上并没有明显的、特异的加德纳氏菌菌落生长，而全部是质地疏松、不透明、呈现或松或紧的蜘蛛网、绒毛状的真菌菌落，如图3 所示。

图3 菌落形态特征Fig.3 Colony morphological characterisitcs

2.4 犬腺病毒检测结果

利用PCR方法对采集的脏器和血液进行了检测，均未检测到犬腺病毒（CAV），结果如图4 所示，说明此次狐狸流产不是由犬传染性肝炎感染引起的。

图4 犬腺病毒PCR 检测结果Fig.4 PCR test result of canine adenovirus

2.5 霉菌毒素ELISA检测

2.5.1 标准曲线的绘制 共检测了5 种霉菌毒素，分别为黄曲霉毒素总量、伏马毒素、T-2 毒素、赭曲霉素和玉米赤酶烯酮。根据ELISA检测试剂盒的标准操作程序，绘制了5 种霉菌毒素的标准曲线，结果如图5 所示。根据此标准曲线，计算出R2值均在0.95 以上，可用于霉菌毒素含量的测定。

图5 霉菌毒素标准曲线Fig. 5 Standard curve of mycotoxin

2.5.2 样品中霉菌毒素含量的测定及计算 根据每一种霉菌毒素ELISA检测试剂盒的操作流程，对流产狐狸肝脏、胃、肠系膜淋巴结、脾脏进行了霉菌毒素检测。使用酶标仪检测各样品的OD450 nm 值，将其带入图 5中相应标准曲线，计算出霉菌毒素的含量（需要乘以样品的稀释倍数），结果见表1。由表1 可知，在流产狐狸的肝脏、脾脏、淋巴结与胃中均检测到黄曲霉毒素总量（AFT）分别为5.813、7.261、6.937、7.017g/kg，而其他霉菌毒素检测值均较低。

表1 样品中毒素含量Table 1 The toxin content in samples （g/kg）

表1 样品中毒素含量Table 1 The toxin content in samples （g/kg）

霉菌毒素 Mycotoxins 肝脏 Liver 胃 Stomach 淋巴结 Lymph nodes 脾脏 Spleen黄曲霉毒素总量 Aflatoxin total amount 5.813 7.261 6.937 7.017伏马毒素 Fumonisin 0 0 0 0 T-2 毒素 T-2 toxin 0 0 0 0赭曲毒素 Ochratoxin 0 0 0 0玉米赤霉烯酮 Zearaleaone 0 0 0 0

3 讨论

该试验通过对流产母狐进行临床观察、病理剖检和实验室检测，再结合对死亡狐狸饲料采食情况的分析，可确定引起此次狐狸流产的病因为黄曲霉毒素中毒。主要原因可能是由于该养殖场的狐狸采食了被黄曲霉毒素污染的饲料而引起的慢性蓄积性中毒所造成的。

由于引起狐狸流产的原因较多，加上黄曲霉毒素中毒属于蓄积性中毒，平时很难发现，等发现后就很难得到纠正，这就造成近年来因霉菌毒素中毒而引起的流产经常发生。尤其是引起狐狸等毛皮动物流产，一旦发现就会发生大面积流产、无法控制和损失惨重[15-17]。

黄曲霉毒素是霉菌毒素中毒性最大、对人类和动物健康危害极为突出的一类霉菌毒素[18]。近年来，在家禽、猪、牛和羊等畜禽中均有发生，给养殖企业带来了严重的损失。黄曲霉菌广泛存在于自然界中，玉米、大豆、花生和豆饼等容易繁殖黄曲霉菌，进而产生黄曲霉毒素。据报道，每粒严重发霉含黄曲霉毒素40g的玉米，可令2 只小鸭中毒死亡，该物质的毒性比毒药氰化钾要强10 倍，1g/kg即可诱发癌变。当动物采食受污染的饲料时，轻则可能出现发热、呕吐、腹泻、食欲减退等症状，重则可能出现生产停滞、肢体浮肿、共济失调和流产死胎等。对人和畜禽的主要中毒表现在神经和内分泌紊乱、免疫抑制、致癌、致畸、肝肾损伤和繁殖障碍等[18]。鸡天生对黄曲霉毒素敏感，饲料中较低的毒素含量就会造成鸡群大量死亡[19]。毒素对蛋鸡的影响集中表现为卵巢和输卵管萎缩、产蛋量下降、产畸形蛋、采食量减少、生产性能下降、饲料报酬降低及种蛋孵化率降低[19-21]。

黄曲霉毒素对猪的危害也很严重，饲料中如果黄曲霉毒素超过200g/kg 时就会表现出明显的临床症状，如生长受阻、免疫抑制等[22-23]。如果饲料中黄曲霉毒素达到1 200～2 000g/kg 时就会出现黄疸、精神沉郁、厌食和死亡等症状。然而，此次检测发现狐狸的肝脏、脾脏、肠系膜淋巴结及胃内的黄曲霉毒素含量分别为 5.813、7.261、6.937 和 7.017g/kg。这个检测结果要比引起猪中毒的数值低得多，说明狐狸对黄曲霉毒素可能要比猪敏感。

近年来，狐狸流产的发病率不断增高，有些养殖场发病率高达50%～70%，给养殖户带来了严重的经济损失。然而，人们一直在关注由病原微生物感染、营养不良和维生素缺乏引起的流产，而忽视了霉菌毒素尤其是黄曲霉毒素中毒引起的流产。通过该研究可使人们清晰认识到黄曲霉毒素中毒在引起狐狸流产的因素中确实很严重、危害很大。由于黄曲霉毒素广泛存在于土壤、动植物和各种坚果中，特别容易污染花生、玉米、稻米、大豆和小麦等粮油产品[23-24]。经过此次现场调查发现，该狐狸场发生狐狸流产的原因就是由于谷物性饲料发霉变质导致的。由于狐狸饲喂膨化玉米，发霉后很难被发现，这也是近年来狐狸流产多发却找不到流产原因的根本原因。

4 防控措施

4.1 杜绝饲喂发霉变质的饲料

要严格把控狐狸谷物性饲料的质量关，尤其是膨化玉米、小麦粉等饲料。杜绝使用发霉的谷物性饲料饲喂动物，控制饲料加工、配制和运输等环节，控制饲料的储存环境，尽量缩短储存时间，防止饲料饲喂期间发霉变质[19]。

4.2 合理使用饲料防霉剂

饲料防霉剂要具备抑制霉菌生长，但又对动物无毒的特点[25]。因此，作为饲料防霉剂，必须符合以下3个原则：一是具有较强的广谱抑菌效果；二是pH值低，在低水分饲料中能释放出来；三是操作方便，使用安全、经济、无致癌、致畸和致突变作用[25-26]。另外还要求在有效添加量范围内不影响动物健康及饲料的适口性。目前，常用的防霉剂主要有以下3 大类：第1 类为有机酸，如丙酸、山梨酸、苯甲酸、乙酸、脱氢醋酸和富马酸等；第2 类为有机酸盐及其酯，如丙酸盐、山梨酸钠（钾）、苯甲酸钠和富马酸二甲酯等[12]；第3 类为复合防霉剂。有机酸防霉效果较好，但腐蚀性较大。有机酸盐的防霉效果较有机酸差，且必须在有一定的水分和一定pH 值的条件下才能进行，但腐蚀性小；复合防霉剂防霉效果作用强、腐蚀性小[27-28]。

4.3 霉菌毒素中毒的治疗

更换饲料无疑是最有效解决霉菌中毒的方法，在提供无污染的饲料后再使用一定量的霉毒清或制霉菌素，大多数霉菌毒素中毒的狐狸会很快恢复健康[27]。此外，补充维生素（如维生素E 和维生素C 等）可以部分抑制T-2 毒素和赭曲毒素对狐狸的毒害[28]。N-乙酰半胱氨酸和硫胺也能降低黄曲霉毒素的毒性，其原因是增加了谷胱甘肽的合成。