健脾补肾法对肺癌化疗小鼠RAS、Bcl-2、FLIP、IL-2、NK 水平的影响

郑春素

（福建中医药大学中医学院，福建 福州350122）

肺癌是发病率和病死率增长最快的恶性肿瘤之一，严重威胁人类的健康和生命。 近50 年来，许多国家报道肺癌的发病率和病死率均明显增高，占所有恶性肿瘤的第1 位［1］。 因肺的解剖位置较特殊，肺门血管、支气管结构复杂，加之肺癌早期诊断较为困难，85%～90%的患者就诊时已是中、 晚期，失去了手术机会，且预后较差，总体5 年生存率只有15%左右。 在我国约70%～80%的肺癌患者接受化疗，但抗癌药物所致的不良反应限制了癌症治疗的最佳用药［2］。 健脾补肾法在肺癌化疗过程中具有一定的疗效，本项目通过健脾补肾药物对肺癌小鼠模型的干预，观察肾素血管紧张素（renin-angiotensin system，RAS）、B 淋巴细胞瘤-2 基因（B-cell lymphoma-2，Bcl-2）、转换酶抑制蛋白（inhibitory protein，FLIP）、白细胞介素-2（Interleukin-2，IL-2）、自然杀伤细胞（natural killer cell，NK）等指标的变化，以期从健脾补肾法对RAS 调节机制的影响探讨健脾补肾法的作用，为中西医结合治疗肺癌提供实验数据。

1 实验材料

1.1 实验动物及细胞 50 只雄性6～8 周SPF 级C57BL ／ 6 纯系小鼠，体质量（20±2）g，由福建中医药大学实验动物中心代购，动物合格证号：SCXK（闽）2019-089。 小鼠Lewis 肺癌细胞株购于江苏凯基生物细胞库。

1.2 实验药物 健脾补肾法药物组成：人参15 g，党参15 g，白术12 g，黄芪15 g，淮山药10 g，枸杞15 g，首乌15 g，肉苁蓉12 g，熟地黄12 g，山萸肉12 g。 由福建中医药大学附属第三人民医院提供，药物煎煮2 次，分别加10 倍、8 倍的水煎煮60、40 min，合并煎煮液，过滤后，浓缩至含生药量1.0 g ／mL，置于4 ℃冰箱保存备用。顺铂注射液（上海上药信谊药厂有限公司公司，批号：20183341）。

1.3 实验试剂 小鼠NK 细胞试剂盒、小鼠IL-2 ELISA 试 剂 盒、RAS 抗 体 试 剂 盒、Bcl -2 抗 体 试剂盒、FLIP 抗体试剂盒（美国Affinity 公司，批号：E00097-203，202003251，84v2118，11o9905，43d3773）。

2 实验方法

2.1 分组与造模 将50 只小鼠常规饲养1 周后，随机分为正常组10 只和造模组40 只。 造模组小鼠适应喂养1 周后，将小鼠Lewis 肺癌细胞以8×105个／ 只注射到小鼠腋窝皮下成瘤［1］，取其瘤体组织，剪碎后加入适量生理盐水，用玻璃研磨器制备成细胞悬浊液，200 目钢网过滤，取过滤后的细胞悬浊液予台盼蓝染色计数， 调节细胞悬浊液浓度为1×107个／ mL，然后将悬液接种于小鼠右下腋窝皮下，每只0.1 mL，所有操作均在无菌条件下进行。

2.2 给药 将造模组随机分成模型组、中药组、化疗组、综合组，每组10 只。 化疗组予顺铂进行化疗，隔日给药，共给药3 次，即第1、3、5 天给药，计算小鼠顺铂的等效剂t 为4.8 mg ／ （kg·d），顺铂注射液1 mg ／ mL，平均每只小鼠腹腔注射剂量为0.1 mL ／（mg·d）（含DDP 0.1 mg）；腹腔注射化疗同时，予生理盐水0.4 mL ／ （只·d）灌胃。 参考周氏［3］等计算方法，根据人和小鼠体表面积折合法，中药组予补脾益肾法药液按0.4 g ／ （kg·d）灌胃；同时于 第l、3、5天，予0.9%生理盐水0.l mL ／ （只·d）进行腹腔注射。 综合组予顺铂化疗联合中药药液灌胃，给药剂量、方法同化疗组和中药组。 模型组和正常组给予0.9%生理盐水0.4 mL ／ （只·d），灌胃，共连续灌胃12 d，于第1、3、5 天，予0.9%生理盐水0.1 mL／（只·d）腹腔注射。 各组12 d 为1 个治疗周期，共进行4 个治疗周期。

2.3 取材 各组小鼠均造模成功后第13 天进行无菌取脾并制备脾细胞悬液。

2.4 观察指标及方法

2.4.1 脾脏NK 细胞活性及IL-2 含量检测 采用乳酸脱氢酶（LDH）释放试验检测小鼠脾脏NK 细胞活性，采用双抗体夹心ELISA 法检测小鼠脾上清液中IL-2 的含量。

2.4.2 RAS、Bcl-2、FLIP 蛋白表达 采用Western Blot 法检测小鼠RAS、Bcl-2、FLIP 的表达。

2.5 统计学方法 应用SPSS 17.0 统计软件进行数据分析。 计量资料以（±s）表示，符合正态分布采用单因素方差分析，模型组与治疗组间比较采用Dunnet 检验。

3 结 果

3.1 肺癌小鼠模型的建立 将Lewis 肺癌细胞悬液接种于小鼠腋窝皮下，接种7 天后，可见小鼠腋下明显成瘤组织，病理观察可见模型小鼠肿瘤细胞的细胞核大小及形态不一，肿瘤细胞呈圆形且有异常核分裂。 具体见图1。

图1 肺癌小鼠模型建立

3.2 5 组小鼠脾脏NK 细胞活性和IL-2 含量比较见表1。

表1 5 组小鼠脾脏NK 细胞活性和IL-2 含量比较（±s）pg ／ mL

表1 5 组小鼠脾脏NK 细胞活性和IL-2 含量比较（±s）pg ／ mL

注：与正常组比较，1） P＜0.05；与模型组比较，2） P＜0.05，3） P＜0.01。

组别正常组模型组化疗组中药组综合组n 10 10 10 10 10 IL-2 28.31±3.43 9.79±2.561）15.61±3.411）2）18.31±3.171）3）21.96±3.361）3）NK 细胞活性4.54±0.96 5.48±1.151）5.37±0.49 5.02±1.091）2）4.94±0.091）2）

3.3 5 组小鼠RAS、Bcl-2、FLIP 蛋白比较 见图2、表2。

图2 5 组小鼠RAS、Bcl-2、FLIP 蛋白电泳图

4 讨 论

中医古籍中并无肺癌一病名，根据肺癌的临床表现，可将其归属于 “肺痿” 范畴。 肺癌的形成与正气不足有着密切的关系，正气虚损是肿瘤发生及转移的主要原因。 此外，肿瘤化疗药物对肿瘤缺乏特异性的选择作用，在杀伤肿瘤细胞的同时也损坏机体的正常组织和细胞，损伤人体的正气，导致脾肾损伤，进一步加重疾病进展。 肺癌病位在肺，与脾肾两虚关系最密切，健脾补肾法作为治疗肺癌的基本治法，可以使气血津液生化充足，阴阳平衡，同时寓有 “培土生金”“金水相生” 之意［4］。

表2 5 组小鼠RAS、Bcl-2、FLIP 蛋白相对表达量比较（±s）

表2 5 组小鼠RAS、Bcl-2、FLIP 蛋白相对表达量比较（±s）

注：与正常组比较，1） P＜0.05；与模型组比较，2） P＜0.05，3） P＜0.01。

FLIP 10.52±1.05 25.08±1.151）21.64±1.271）2）15.92±1.081）3）13.92±0.981）3）组别正常组模型组化疗组中药组综合组RAS 0.52±0.03 0.86±0.061）0.73±0.051）2）0.68±0.041）3）0.63±0.041）3）Bcl-2 11.06±1.27 19.63±1.411）15.42±1.331）2）13.35±1.211）3）12.27±1.181）3）

大量的临床及实验研究证明健脾补肾中药能够提高机体的免疫功能，增强抵抗力，延长肿瘤患者的生存期，同时能保护骨髓造血机能，拮抗化疗引起的周围白细胞下降的现象，提高机体耐受化疗的能力，为进一步提高肿瘤化疗的作用创造了条件［5-7］。 RAS 与肿瘤关系密切，本课题组前期研究发现RAS、Bcl-2、FLIP 的表达水平与肺癌的发生发展密切相关，Bcl-2、FLIP 与RAS 呈显著的正相关，IL-2 与RAS 呈显著的负相关，NK 与RAS 没有明显的相关性［8-10］。 本研究结果显示，中药组、综合组小鼠IL-2、NK、RAS、Bcl-2、FLIP 等指标均较 模型组明显改善，推测健脾补肾法可能通过调节免疫功能降低Bcl-2、FLIP 水平，进而调节RAS。随着研究的不断深入，能否将RAS、Bcl-2、FLIP 等指标作为肿瘤药物治疗的靶点及依据，进而为中西医结合治疗肺癌进行一些有益的尝试是需要我们不断关注与探索。