响应面法优化超声辅助提取菜籽蛋白工艺参数的研究

李逸鹤 程婷婷

摘要：菜籽蛋白是一种非常具有开发价值的植物蛋白，而利用超声辅助提取可以有效提高菜籽蛋白的提取率。本研究通过响应面法优化了超声辅助进行菜籽蛋白提取的工艺参数，结果表明：超声频率28kHz、超声时间40.1min、超声温度51℃、超声强度为44W/L时，菜籽蛋白的提取率为91.35%，在此条件下提取效果最好。

关键词：超声处理;菜籽蛋白;提取工艺;菜籽粕

中图分类号：TS225.14

作者姓名：李逸鹤，男，硕士，讲师，研究方向为谷物、食品加工教学。

菜籽粕中富含菜籽蛋白[1]，而菜籽蛋白是一种全价蛋白，没有限制氨基酸，并且具有较高的营养价值和生理活性[2-3]。菜籽蛋白消化率在95%～100%，其蛋白效价比大豆蛋白还高，也高于酪蛋白[4]。因此，通过对菜籽蛋白的提取和开发，使之成为新型优质植物蛋白资源，扩大其在食品加工领域地应用，具有良好的市场前景。

目前，碱提酸沉法是菜籽蛋白目前科研和实际生产最常用的提取方法，但其缺点为蛋白质得率相对低[5]。超声辅助提取技术被认为是一种有效的提取技术，可以显著缩短工作时间，提高产量和质量[6]。超声效应主要包括热效应、机械效应和空化效应三种。其中空化效应是超声波与液体介质相互作用的主要超声效应[7]。通过空化效应可以破坏植物的细胞壁，使蛋白能够更容易浸出，从而提高菜籽蛋白的提取率。因此，本文通过对超声辅助提取菜籽蛋白的工艺进行研究，以得到最佳的工艺参数，为菜籽蛋白的开发利用提供有效的帮助。

1 试验方法

1.1 试剂与材料

菜籽粕：中粮张家港东海粮油有限公司;浓硫酸、乙醚、乙醇、硫酸铜、硫酸钾、氢氧化钠、盐酸：国药集团化学试剂有限公司。

1.2 仪器设备

超声设备：江苏大学食品与生物工程学院制造;DD-5M低速离心机：湖南湘仪试验室仪器有限公司;数显恒温水浴锅：金坛市双捷试验仪器厂;PHS-2C型数显pH计：上海精密科学仪器有限公司;紫外分光光度计：上海棱光技术有限公司。

1.3 试验步驟

（1）菜籽蛋白的提取工艺。菜籽粕去除杂质，研磨过60目筛，用石油醚浸泡2次（1h/次），干燥后放置于4℃冰箱中待用。试验时，以液料比15∶1将10g菜籽粕分散到蒸馏水中，调节pH为12，在提取温度50℃条件下浸提1h，浸提期间每间隔15min测一次pH，并用1mol/L的NaOH溶液调节至初始pH，然后用离心机以4 000r/min的转速离心20min，收集上清液;再利用上述方法进行重复提取固体残渣。最后将两次提取的上清液混合，用Folin-酚试剂法（Lowry法）[8]测定上清液中的蛋白含量，用凯氏定氮法测定菜籽粕中蛋白含量，计算菜籽蛋白提取率。计算公式如下：

蛋白提取率（%）=提取液中蛋白含量÷样品中蛋白含量×100  （1）

（2）超声处理。将pH值调整后的菜籽粕溶液放入超声池中，调节超声参数，进行超声处理。其中超声频率：20kHz、28kHz、35kHz、40kHz、50kHz和60kHz;超声功率：10W/L、20W/L、30W/L、40W/L和50W/L;超声时间10min、20min、30min、40min和50min;超声温度：35℃、40℃、45℃、50℃和55℃;超声工作时间3s，超声间歇时间2s。之后，按照上述菜籽蛋白提取工艺对处理后的菜籽粕溶液展开试验，并计算菜籽蛋白的提取率。

2 结果与分析

2.1 超声参数单因素试验

2.1.1 超声频率对菜籽蛋白提取率的影响

如图1所示，通过超声处理后，菜籽蛋白的提取率都有所提高。这是因为超声通过空化效应使菜籽粕的细胞结构遭到破坏从而使蛋白能够更好地溶出。其中在超声频率为28kHz时，菜籽蛋白的提取率最高。这是因为超声波频率越高，其空化作用强度越低，从而使超声的空化效应降低，所以当其他超声参数不变时，超声频率越高，空化效果越低。同时，由于不同的物质对超声波的敏感程度不同，发生共振的频率不同，从而造成频率方面的差异。因此，最终以超声频率28kHz进行后续试验。

2.1.2 超声时间对菜籽蛋白提取率的影响

如图2所示，随着超声时间的增长，菜籽蛋白的提取率呈现先增加后降低的趋势，在40min时，菜籽蛋白的提取率最大。这说明在超声的空化效应作用下，菜籽粕的细胞结构遭到破坏，使蛋白在提取过程中更容易溶出。当作用时间过长，可能使得部分菜籽蛋白产生变性，降低蛋白的溶出效果，从而导致菜籽蛋白的提取率下降。因此，选定最佳超声时间为40min。

2.1.3 超声温度对菜籽蛋白提取率的影响

如图3所示，超声温度升高，菜籽蛋白的提取率呈现先增加后降低的趋势，在50℃时，提取效果最佳。当温度升高，有利于菜籽蛋白从菜籽粕细胞结构中溶出，同时提高菜籽蛋白的溶解度，从而使提取率增加。当温度过高时，容易导致菜籽蛋白变性，使蛋白的溶解性下降从而降低菜籽蛋白的提取率。因此，最终确定最佳超声温度为50℃。

2.1.4 超声强度对菜籽蛋白提取率的影响

超声强度对菜籽蛋白提取率的影响如图4所示。随着超声强度提高，菜籽蛋白的提取率逐渐增加，这说明随着超声强度的增加，菜籽蛋白更容易从菜籽粕中溶出，从而提高了菜籽蛋白的提取率。但是当超声强度超过30W/L后，增加的速度变的平缓。因此，从试验结果及能量消耗方面考虑，最终确定最佳的超声强度为40W/L。

2.2 响应面法优化试验及结果分析

根据单因素试验结果，选择超声温度、超声时间、超声强度三个因素进行中心组合试验设计进一步优化工艺参数，以菜籽蛋白的提取率为响应值。响应面法优化试验的因素水平如表4所示。利用Design Export软件Box-Behnken设计试验方案及结果如表5所示。

通过软件对试验结果进行拟合，建立回归模型。其二次回归方程为：

Y=91.11+0.27×A+0.67×B+0.95×C-0.34×AB-0.35×AC+0.72×BC-2.65×A2-2.24×B2-1.38×C2  （2）

如表6所示，根据分析结果可以看出该模型P值<0.000 1，说明数学模型非常显著。模型相关系数的置信度为0.990 2，失拟误差不显著（P=0.066 8>0.05）说明本模型的拟合程度好，试验误差小，可以用于对蛋白提取率的预测。能解释约99.02%的响应值与试验数据拟合性良好。B、C、BC、A2、B2、C2是模型的的显著因素，且单因素的影响大小排序为C>B>A。各交互项影响大小的排序为BC>AC>AB。根据软件的分析结果得到预测的最佳蛋白提取条件为：超声时间40.1min，超声温度51℃，超声强度44W/L，在此条件下菜籽蛋白的提取率为91.37%。

2.3 响应面最优条件验证结果

由于优化出来的最优组合未在17组试验中出现，所以需要通过试验来验证其有效性和稳定性。采取最佳超声条件进行预处理，然后得到提取率为91.35%，与预测值接近。

3 结论

本文采用了超声辅助菜籽粕提取菜籽蛋白的工艺参数研究。通过超声的空化效应加速菜籽蛋白的溶出，从而提高菜籽蛋白的提取率。在对超声频率、超声时间、超声强度和超声温度四个单因素进行试验的基础上，以菜籽蛋白提取率为响应值，利用Box-Benhnken设计影响提取率的超声强度、超声时间和超声温度三个主要因素进行了优化。利用软件分析得出了回归模型：Y=91.11+0.27×A+0.67×B+0.95×C-0.34×AB-0.35×AC+0.72×BC-2.65×A2-2.24×B2-1.38×C2。其中超声强度和超声温度及两者之间的交互作用是模型的显著因素，并且优化了工艺参数。

参考文献：

[1]汪兰，陈冉，杜欣，等.菜籽蛋白氨基酸组成分析及與功能特性的相关性研究[J].中国油脂，2012，37（2）：1-7

[2]Manashi D， Anuj K， Sougata S， et al. Effect of maleylation on physicochemical and functional properties of rapeseed protein isolate[J] Journal of Food Science And Technology，2016（53）：1784-1797

[3]金晶，徐志宏.超声微波辅助法提纯菜籽蛋白的研究[J].现代食品科技，2009，25（3）：275-278.

[4]席鹏彬，李德发.中国不同品种菜粕猪回肠氨基酸消化率研究[J].中国畜牧杂志，2002，38（4）：5-7

[5]邹强，王燕.菜籽蛋白提取分离及其功能特性的研究[J].农产品加工·学刊，2010，16（7）：62-65

[6]马海乐，张连波.米糠蛋白的脉冲超声辅助提取技术[J].江苏大学学报：自然科学版，2006，27（1）：14-17.

[7] Yolanda PicoUltrasound-assisted extraction for food and environmental samples [J].Trends in Analytical Chemistry，2013，43：84-99.

[8]Lowry O， Rosebrough N， Farr A， et al. Protein measurement with the Folin phenol reagent[J].Journal of Biological Chemistry，1951，193（1）：265-275.