CSN6对宫颈癌HeLa细胞与SiHa细胞自噬能力的影响研究

李想 于思琪 李彤

摘要：目的  探討组成型光形态发生因子9信号复合体亚基6（CSN6）对宫颈癌HeLa细胞与SiHa细胞自噬能力的影响。方法  购置宫颈癌HeLa细胞与SiHa细胞，并测定腺病毒中GFP与mRFP表达水平，标记、追踪LC3，示踪自噬流的水平;将购置的细胞放置在6孔板中进行培养，随机分为对照序列组、CSN6 siRNA组、空载体质粒组与CSN6过表达组，各组细胞均进行相应的处理（连续完成24 h干预）;采用Western Blot法测定各组细胞中CSN6、LC3蛋白、Beclin1、Atg5表达水平，荧光显微镜下检测两种细胞中自噬体个数，采用四甲基偶氮唑蓝（MTT）法检测各组细胞干预后增殖抑制率。结果  siCSN6组不同宫颈癌细胞中自噬体个数高于siCtrl组，差异具有统计学意义（P<0.05）;siCSN6组CSN6、LC3蛋白、Beclin1、Atg5表达水平高于siCtrl组、siCSN6组及CSN6组，差异具有统计学意义（P<0.05）;CSN6组CSN6、LC3蛋白、Beclin1、Atg5表达水平低于siCtrl组、siCSN6组，差异具有统计学意义（P<0.05）;siCSN6组干预后2、6、12、24、48 h细胞增殖抑制率高于siCtrl组、siCSN6组及CSN6组，差异具有统计学意义（P<0.05）。结论  转染CSN6能提高宫颈细胞的自噬水平，而过表达CSN6则能抑制自噬活性，均会对细胞增殖抑制率产生影响。

关键词：组成型光形态发生因子9信号复合体亚基6;宫颈癌;自噬能力;增殖抑制率

中图分类号：R737.33                                文献标识码：A                                DOI：10.3969/j.issn.1006-1959.2020.17.021

文章编号：1006-1959（2020）17-0073-04

Abstract：Objective  To investigate the effect of constitutive photomorphogenetic factor 9 signaling complex subunit 6 （CSN6） on the autophagy ability of cervical cancer HeLa cells and SiHa cells.Methods  Purchasing cervical cancer HeLa cells and SiHa cells， and determining the expression levels of GFP and mRFP in adenovirus， labeling and tracking LC3， and tracing the level of autophagic flux; the purchased cells were placed in a 6-well plate for culture and randomly divided into control sequence group， CSN6 siRNA group， empty vector plasmid group and CSN6 overexpression group. Cells in each group were treated accordingly （continuously completed 24 h intervention）; Western Blot method was used to determine the CSN6， LC3 protein，the expression levels of Beclin1 and Atg5， the number of autophagosomes in the two types of cells were detected under a fluorescence microscope， and the proliferation inhibition rate of each group of cells after intervention was detected by the tetramethylazazole blue （MTT） method. Results  The number of autophagosomes in different cervical cancer cells in the siCSN6 group was higher than that in the siCtrl group，the difference was statistically significant （P<0.05）; the expression levels of CSN6， LC3 protein， Beclin1， Atg5 in the siCSN6 group were higher than those in the siCtrl group， siCSN6 group and CSN6 group，the difference was statistically significant （P<0.05）; the expression levels of CSN6， LC3 protein， Beclin1， Atg5 in the CSN6 group were lower than those in the siCtrl and siCSN6 groups，the difference was statistically significant （P<0.05）;The cell proliferation inhibition rate in the siCSN6 group was higher than that in the siCtrl group， siCSN6 group and CSN6 group at 2， 6， 12， 24， and 48 h after intervention，the difference was statistically significant （P<0.05）.Conclusion  Transfection of CSN6 could increase the autophagy level of cervical cells， while overexpression of CSN6 could inhibit the autophagy activity， both of which would affect the cell proliferation inhibition rate.

Key words：Constitutive photomorphogenetic factor 9 signaling complex subunit 6;Cervical cancer; Autophagy;Proliferation inhibition rate

宫颈癌（cervical cancer）是临床上发生率较高的女性恶性肿瘤，好发于30～55岁人群中，常见病因包括[1]HPV感染、多性伴侣、多孕多产、单纯疱疹病毒Ⅱ型感染等。患者发病早期临床症状缺乏典型性，随着病情的不断发展，会出现阴道流血、排液等，影响患者健康、生活。自噬在细胞中较为常见，能通过自身的溶酶体等将受损的细胞器/大分子进行溶解，以适应恶劣的生存环境[2，3]。研究表明[4]，自噬在机体中多处于平衡状态，当自噬发生异常后则会诱发肿瘤的发生。近年来，随着医疗技术的不断发展，临床对于自噬研究不断深入，发现自噬在肿瘤的发生、发展中能发挥双重作用[5，6]。组成型光形态发生因子9信号复合体亚基6（CSN6）属于是CSN的关键亚基，且在多种恶性肿瘤中表达水平较高。同时，CSN能与E3泛素连接酶相互作用，从而完成肿瘤细胞增殖、转移及凋亡的调节，但是对于宫颈癌细胞自噬的影响研究较少[7，8]。因此，本研究以宫颈癌HeLa细胞与SiHa细胞为对象，探讨CSN6对宫颈癌HeLa细胞与SiHa细胞自噬能力的影响，报道如下。

1材料与方法

1.1材料来源  2018年8月～2019年6月购置宫颈癌HeLa细胞与SiHa细胞作为对象，所有细胞均源于中国上海中科院生物研究所。

1.2仪器与设备  本实验主要仪器及设备及厂家情况见表1。

1.3方法

1.3.1 细胞的培养、复苏及处理  将购置的宫颈癌HeLa细胞与SiHa细胞从液氮中取出，37 ℃恒温水浴锅中手动摇晃（加快细胞溶解），待2/3体积的冻存液溶解;超净工作台上打开封口膜，放入完全培养液10 ml的离心管中，5 min离心，速度1000 rpm;去除上清，采用DMEM完全培养液5 ml完成细胞沉淀重悬，利用适当力度吹打细胞，混合后将其放置在细胞培养瓶中。标记相应细胞的类型、处理时间后，经酒精消毒后放置在细胞培养箱内进行培养（5%CO2、温度37 ℃）。倒置显微镜下观察细胞形态、是否获得良好贴壁，当培养液变黄后完成细胞首次全量换液（换液前采用PBS缓冲液完成3次清洗），加入浓度为10.0%的PBS新鲜培养基继续培养，待细胞融合瓶底80.0%以上后完成细胞传代培养。取传代后的细胞，离心完毕后去除上清，根据实验所需，调整细胞密度，备用[9，10]。

1.3.2自噬双标腺病毒示踪自噬流  采用单体红色荧光蛋白耦合到绿色荧光蛋白-LC3（mRFP-GFP-L3）串联荧光蛋白腺病毒中表达的GFP与mRFP，并标记、追踪LC3，示踪自噬流的水平。CFP减弱能指示溶酶体与自噬小体融合形成自噬溶酶体，在显微镜下对于细胞中存在黄色斑点即为自噬体。采用自噬双标腺病毒完成HeLa细胞与SiHa细胞的转染（每2 h换液1次），连续进行24 h干预，荧光显微镜下每孔取视野5个，观察mRFP-GFP-LC3荧光斑点数量[11]。

1.3.3细胞分组与处理  取上述处理后的宫颈癌HeLa细胞与SiHa细胞，将其放置在6孔板中进行培养，随机分为对照序列组（siCtrl组）、CSN6 siRNA组（siCSN6组）、空载体质粒组（Vector组）与CSN6过表达组（CSN6组），各组细胞均进行相应的处理（连续完成24 h干预）。采用slLent-Fect转染试剂向siCtrl组完成阴性对照序列助燃，siCSN6组转染CSN6 siRNA，各组细胞均连续完成24h干预。同时，采用Roche转染试剂转染Vector组细胞[pcDNA3.1（+）-空载体质粒];采用pcDNA3.1（+）-CSN6过表达，转染CSN6组细胞，各组细胞均连续完成24 h干预，荧光显微镜下检测不同细胞中自噬体个数。

1.3.4自噬相关基因蛋白水平  取各组干预后的细胞，加入蛋白裂解液200 μl，30 min裂解，温度4 ℃，10 min离心，速度为12000 rpm，离心半径为5.5 cm，上述操作完毕后将获得的上清移到高压消毒的EP管中。根据相关说明采用Western Blot法测定各组细胞中CSN6、LC3蛋白、Beclin1、Atg5表达水平。请各组样品40 μg完成SDS-PAGE电泳，转膜到聚篇二氟乙烯（PVDF）膜，并利用浓度为5%胎牛血清白蛋白（BSA）完成1 h封闭。同时，根据蛋白分子量完成条带切割，分别加入CSN6、LC3蛋白、Beclin1、Atg5蛋白一抗，常温下完成2h孵育，经洗膜、显色、显影等操作后拍照[12]。

1.3.5细胞增殖抑制率  采用四甲基偶氮唑蓝（MTT）法检测各组细胞干预后增殖抑制率，取四组处理后的细胞，根据5×103个接种在96孔培养板中，待细胞贴壁后分别加入不同浓度的、新鲜配置的ASP培养基200 μl（浓度为0.5、1.0、2.5、5.0、10.0、20.0 mmol/L），各组均连续完成48 h培养，设置阴性对照组（加入等体积不含有ASP的培养基）。向每孔中加入MMT液20 μl，浓度为5 mg/ml，连续完成4 h孵育，去除上层清液，向每孔中加入DMSO液150 μl，摇床上连续完成10 min干预。在酶标仪492 nm下完成吸光度值A值测定，根据公式计算细胞增殖率（%）[抑制率=1-A测定细胞/A阴性对照組]×100.00%[13]。

1.4统计学分析  采用SPSS 18.0软件处理数据，计数资料采用[n（%）]表示，行？字2检验，计量资料采用（x±s）表示，行t检验，P<0.05表示差异有统计学意义。

2结果

2.1不同细胞中自噬体个数比较  荧光显微镜下完成宫颈癌HeLa细胞与SiHa细胞中mRFP-GFP-LC3荧光斑点数量，siCSN6组不同宫颈癌细胞中自噬体个数高于siCtrl组，差异有统计学意义（P<0.05），见图1。

2.2四组自噬相关基因蛋白水平比较  siCSN6组CSN6、LC3蛋白、Beclin1、Atg5表达水平高于siCtrl组、siCSN6组及CSN6组，差异有统计学意义（P<0.05）;CSN6组CSN6、LC3蛋白、Beclin1、Atg5表达水平低于siCtrl组、siCSN6组，差异有统计学意义（P<0.05），见图2。

2.3四组细胞增殖抑制率比较  siCtrl组、siCSN6组不同时间点细胞增殖抑制率比较，差异无统计学意义（P>0.05）;siCSN6组干预后2、6、12、24及48 h细胞增殖抑制率高于siCtrl组、siCSN6组及CSN6组，差异有统计学意义（P<0.05）;CSN6组不同时间点细胞增殖抑制率高于siCtrl组、siCSN6组，差异有统计学意义（P<0.05），见表2。

3讨论

宫颈癌是女性发病率较高的生殖系统恶性肿瘤，由于患者发病早期临床症状缺乏典型性，导致远期预后较差。因此，积极研发宫颈癌新的治疗方法、策略成为研究的热点。细胞自噬是真核生物中进化保守的、对细胞内物质周围较为重要的过程，该过程中损坏的蛋白或细胞器被双层膜结构的自噬小泡包裹后，能进入溶酶体、液泡中进行降解并循环使用。临床研究表明：细胞自噬过程是细胞成分分解、回收利用的重要基础，多用于营养缺乏状态下培养的细胞、植物的免疫反应、叶片衰老等。细胞自噬属于较为重要的生物学现象，能直接参与生物的发育、生长等过程，当细胞自噬异常时则会出现癌细胞。本研究中，siCSN6组不同宫颈癌细胞中自噬体个数高于siCtrl组，差异有统计学意义（P<0.05），说明CSN转染能改变细胞自噬体的数量，可能直接参与宫颈癌的发生、发展。CSN6属于是CSN的关键亚基，在诸多恶性肿瘤中表达，与致癌活性相关，且临床对于CSN6的研究更多的集中在调节E3泛素连接酶介导的癌症相关蛋白泛素化水平，从而能调节肿瘤细胞的周期、增殖、转移与凋亡，但是临床对于肿瘤细胞自噬的机制尚未肠阐明。

CSN最初发现于南芥中光依赖性生长与转录的阻遏物，属于是一种泛素-蛋白酶体调节剂。临床研究表明：CSN主要由9个不同的亚基组成，在多种恶性肿瘤中呈高表达，其表达水平与肿瘤细胞的活性有关。多种肿瘤抑制因子、致癌因子均受到CSN的影响，并且CSN6亦可与E3泛素连接酶相互作用、结合，能同届机体泛素化水平，从而在肿瘤周期的调节、肿瘤细胞的增殖与凋亡中发挥重要作用。本研究中，Western Blot法测定结果表明：siCSN6组CSN6、LC3蛋白、Beclin1、Atg5表达水平高于siCtrl组、siCSN6组及CSN6组（P<0.05）;CSN6组CSN6、LC3蛋白、Beclin1、Atg5表达水平低于siCtrl组、siCSN6组（P<0.05），说明CSN6在宫颈癌细胞自噬的调节中发挥了重要的作用。既往研究表明：CSN6能提高SCF泛素连接酶的生物活性，能降解哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）活性，从而能调节细胞自噬作用。CSN6已经证实在多种恶性肿瘤中呈高表达，与致癌活性有关，能与E3泛素连接酶及相关的靶蛋白结合，调节其泛素化水平。CSN6能增强SCF泛素连接酶的亚基Fbxw7的自我泛素化与降解。而Fbxw7能靶向降解哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mTOR），是调控自噬起始的关键复合物。国外学者研究表明：宫颈癌细胞中自噬活性水平降低与疾病的发生有关，有效的提高肿瘤细胞自噬活性，能为宫颈癌治疗提供新的思路与方法。本研究中，siCSN6组干预后2、6、12、24及48 h细胞增殖抑制率高于siCtrl组、siCSN6组及CSN6组（P<0.05），说明CSN6能提高宫颈癌细胞的姿势能力，提高细胞的增殖抑制率，有望成为宫颈癌新的治疗靶点。

总之，转染CSN6能提高宫颈细胞的自噬水平，过表达CSN6能抑制自噬活性，均会对细胞增殖抑制率产生影响，能为宫颈癌治疗提供新思路。

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收稿日期：2020-07-08;修回日期：2020-07-23

编辑/成森