玫瑰红芪当归水煎剂对围绝经期大鼠子宫病理形态及ER表达的影响

陈雪娟， 安方玉， 颜春鲁， 刘雪松， 邓 婕， 赵崇博， 王国文

(1. 甘肃中医药大学 基础医学院， 兰州 730000； 2. 甘肃中医药大学 教学实验实训中心， 兰州 730000； 3. 甘肃中医药大学 中西医结合学院， 兰州 730000； 4. 甘肃中医药大学 临床医学院， 兰州 730000)

围绝经期综合征是因中老年妇女的卵巢功能衰退或丧失而引起激素代谢紊乱，从而出现一系列潮热、盗汗、眩晕、耳鸣等临床症状的一种综合征。临床以激素替代疗法为本病的主要治疗手段[1]，但长期的激素治疗会增加患者患心脑血管疾病和各类妇科类癌症的风险[2-3]。如何降低激素替代治疗的副作用和提高围绝经期综合征的疗效是目前关注的焦点。

传统中药以低毒、安全、高效的优势，在围绝经期综合征的治疗中备受关注。研究发现[4-5]，中药复方或单体在治疗围绝经期综合征方面的确有效，但具体治疗机制仍处于探索阶段。为此，本研究通过观察玫瑰红芪当归水煎剂对围绝经期综合征模型大鼠血清雌激素含量变化、子宫组织雌激素受体的表达变化和子宫组织病理形态学变化的影响，初步探讨其对围绝经期综合征大鼠体内激素变化的调控机制，为其临床应用提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物

SPF级6周龄雌性Wistar大鼠，体重180～220 g，甘肃中医药大学科研实验中心动物饲养室提供，合格证号 SCXK(甘)2011-0007。所有大鼠自由饮水、摄食1周，本动物实验经甘肃中医药大学动物伦理委员会批准进行，实验动物符合伦理委员会规定。

1.1.2 试剂

大鼠雌二醇(E2)ELISA检测试剂盒(上海源叶生物科技有限公司，批号201708)；Trizol Reagent 试剂(美国，批号 47123)；GoScript TM Reverse Transcription System 试剂盒和 GoTaq qPCR Master Mix 试剂盒(Promega，批号分别为0000073135和0000121531)；戊酸雌二醇片(拜耳医药保健有限公司广州分公司，规格1 mg/片，批号156A)，Rat ERα Polyclonal Antibody(Immuno way公司，Catalog No：YT1634)和Rat ERβ Polyclonal Antibody(Immunoway公司，Catalog No：YT1637)。

1.2 方法

1.2.1 药物给药剂量

玫瑰红芪当归(分别产自甘肃苦水、陇西和岷县)水煎剂由玫瑰6 g，红芪15 g，当归10 g组成(中药的剂量依据2010版《中国药典》)，均购自甘肃中医药大学附属医院，由甘肃中医药大学科研实验中心夏鹏飞老师鉴定。具体换算方法参考文献[6]，玫瑰红芪当归水煎剂人用剂量是31 g/d，换算成标准体重大鼠的剂量为：31×0.018=0.558 g/鼠，按照大鼠的标准体重为200 g，得出大鼠的剂量为0.558 g×5≈2.8 g/kg，以此计算所得剂量作为干预的中剂量，即玫瑰红芪当归水煎剂低、中、高剂量分别为1.4、2.8和5.6 g/kg。戊酸雌二醇片的给药剂量为0.09 mg/kg。

1.2.2 围绝经期综合征大鼠模型的建立

将70只Wistar雌性大鼠随机分为正常组(15只)和卵巢切除组 (55只)，参照文献[7-8]，采用手术切除法切除卵巢切除组大鼠的双侧卵巢。每只大鼠分别以 10% 水合氯醛溶液腹腔注射麻醉后，俯卧位下无菌切除其双侧卵巢，正常组大鼠仅切除卵巢周围约卵巢大小的脂肪组织，不切除卵巢。造模后第7天正常组和卵巢切除组各取5只大鼠，用ELISA法检测两组大鼠的血清雌二醇 (estradiol，E2)含量以判定造模是否成功。

1.2.3 分组与给药

根据参考文献[5]，于术后第2周根据体重随机将卵巢切除组的大鼠分为卵巢切除组、玫瑰红芪当归水煎剂低、中、高剂量组(1.4、2.8和5.6 g/kg)和戊酸雌二醇片组(阳性对照组，0.09 mg/kg)，每组10只。各干预组的给药体积均为10 mL/kg，灌胃给药，正常组和卵巢切除组给予等体积蒸馏水，1次/d，连续6周。末次给药后，称量各组动物体重后，股动脉采血处死各组动物，制备血清，同时开腹摘取各组动物的双侧子宫，并将子宫周围附着的脂肪组织剥离干净备用。

1.2.4 动物体重及子宫系数测定

称取各组动物的体重及子宫湿重，计算子宫系数。子宫系数(mg/g)=子宫质量(mg)/体重(g)

1.2.5 血清E2含量的测定

ELISA法测定各组动物的E2含量。将制备好的血清作为待测样品，分别设置空白孔、标准孔和待测样品孔，空白孔不加任何物质，标准孔加入各浓度的标准品，待测样品孔加入血清，37 ℃孵育30 min，弃去孔内液体，每孔加满洗涤液，静置30 s后弃去孔内液体，重复5次，除空白孔外，每孔加入50 μL的酶，37 ℃孵育30 min，洗涤后加入终止液50 μL，450 nm处测定各管的吸光度值。绘制标准曲线，通过回归方程计算血清E2的含量。

1.2.6 子宫组织的病理学切片检测

将上述称量后的子宫每组取6个用4%多聚甲醛固定，将固定好的组织送兰州军区总医院病理科，采用石蜡包埋法制作蜡块，并用切片机切片，切片厚度约5 μm，HE 染色，封片、镜检。

1.2.7 子宫组织ERα和ERβ基因表达的测定

提取子宫组织RNA，Q5000核酸微量测定仪测定其260 nm处的含量和260/ 280的比值。取2.5 μg的RNA样品反转录合成 cDNA 第一链。大鼠ERα、ERβ的引物序列合成由TakaRa公司完成。ERα上游引物：5′-CACTCGATC ATTCGAGCACATTC-3′，下游引 物： 5′-AAGGGTCATGGTCATGGTCAG-3′；ERβ上游引物：5′- GTACCATAGACAAGAACCGGCGTAA -3′，ERβ下游引物：5′-TCCGCACTATACGGTACCCACA-3′；以GAPDH为内参，上游引物： 5′-TGA AGGTCGCTGTCAACGGA-3′，下游引物：5′-GATGGCATGGACTGTGGTCAT-3′。实时荧光定量PCR中所用的材料包括cDNA、上下游引物、SYBR混合液、Rox染料和水；PCR扩增反应条件如下： 95 ℃预变性2 min；95 ℃变性15 s， 58 ℃退火45 s，60 ℃延伸 1 min，共 45 个循环。每个样品各重复 3 次，数据经 2-ΔΔCt处理后进行ERα和ERβ基因相对表达量分析。

1.2.8 子宫组织ERα和ERβ蛋白表达的测定

根据ERα和ERβ的抗体说明书确定ERα和ERβ的浓度分别为1∶400和1∶100，同时用PBS 缓冲液代替一抗设立阴性对照，染色步骤按试剂盒说明书进行。免疫组化数据分析采用软件Image proplus 6.0对各组染色结果进行分析，每组取6张切片，每张切片取5个视野，最后取其平均值作为该切片的OD值。

1.2.9 统计学分析

2 结果与分析

2.1 玫瑰红芪当归水煎剂对大鼠体重及子宫系数的影响

由表1可知，与正常组相比，卵巢切除组大鼠的体重明显升高，子宫系数明显下降(P<0.05)；与卵巢切除组相比，玫瑰红芪当归水煎剂中、高剂量组和戊酸雌二醇片组大鼠体重明显降低，子宫系数明显增加(P<0.05)。

表 1 对各组大鼠体重及子宫系数测定结果的影响

2.2 玫瑰红芪当归水煎剂对大鼠血清E2含量的影响

与正常组相比，卵巢切除组大鼠的血清E2含量明显降低(P<0.05)；与卵巢切除组相比，玫瑰红芪当归水煎剂各给药组和戊酸雌二醇片组大鼠的血清E2含量明显增加(P<0.05)。具体结果见表2。

表2 对各组大鼠血清E2含量测定结果的影响

2.3 玫瑰红芪当归水煎剂对大鼠子宫组织病理形态变化的影响

从图1可以看出，正常组大鼠子宫管径较粗，内膜深厚，腺体丰富，单层柱状上皮细胞排列整齐；卵巢切除组、玫瑰红芪当归水煎剂低、中剂量组大鼠子宫壁明显变薄，管腔狭窄，黏膜层腺体消失，固有层细胞密集，柱状上皮细胞排列紊乱；玫瑰红芪当归水煎剂高剂量组大鼠子宫壁变薄，管腔狭窄，黏膜层出现腺体，单层柱状上皮细胞排列整齐；戊酸雌二醇组大鼠子宫壁变薄，管腔狭窄，单层柱状上皮细胞排列整齐。

2.4 玫瑰红芪当归水煎剂对大鼠子宫组织ERα和ERβ基因表达的影响

由表3可知，与正常组相比，卵巢切除组大鼠子宫组织的ERα和ERβ基因表达均明显降低(P<0.05)；与卵巢切除组相比，玫瑰红芪当归水煎剂中、高剂量组和戊酸雌二醇片组大鼠宫组织的ERα和ERβ基因表达均明显增加(P<0.05)。

子宫由肌层和子宫内膜构成；子宫内膜从外向内依次为上皮、腺体和基质层构成，可以形成腔管状结构；子宫的各层结构见图片中的箭头所示

ERα和ERβ的熔点曲线、扩增曲线结果，见图2和图3。

表3 各组大鼠子宫组织的ERα和ERβ基因表达情况

图2ERα和ERβ的熔点曲线

Figure 2 Melting point curve ofERαandERβ

图 3 ERα和ERβ的扩增曲线

2.5 玫瑰红芪当归水煎剂对大鼠子宫组织ERα和ERβ蛋白表达的影响

ERα在子宫内膜基质细胞 、腔上皮 、腺上皮和子宫肌层中均有表达。与正常组比较，卵巢切除组大鼠子宫腔上皮及基质中ERα的表达水平均显著降低(P<0.05)；与卵巢切除组比较，玫瑰红芪当归各剂量组均能上调子宫中的雌激素受体 ERα蛋白的表达，其中、高剂量组差异有统计学意义(P<0.05)。具体结果见表4和图4。

表4 各组大鼠子宫组织ERα和ERβ的蛋白表达情况

图4ERα在各组大鼠子宫组织中的表达情况(免疫组化，200×)

Figure 4 Expression of ERαin uterine tissue in each group(IHC，200×)

由表4和图5可知，子宫中ERβ呈弱表达，主要表达在子宫腔上皮中、子宫腺体及基质中。与正常组比较，卵巢切除组大鼠子宫腔上皮及基质中ERβ表达水平均显著降低(P<0.05)；与卵巢切除组比较，玫瑰红芪当归各剂量组和戊酸雌二醇片组大鼠子宫腔上皮及基质中 ERβ的表达水平均显著升高，其中、高剂量组差异有统计学意义(P<0.05)。

3 讨论与结论

玫瑰红芪当归水煎剂主要由玫瑰、红芪和当归组成，方中玫瑰具有疏肝、理气、活血等作用，红芪有固表止汗、补气利尿、托毒敛疮等作用，当归有补血活血、养血滋补和调经止痛等作用。根据玫瑰红芪当归水煎剂功效推测其能够治疗围绝经期综合征。

图5 ERβ在各组大鼠子宫组织中的表达情况(免疫组化， 200×)

本实验采用去卵巢法制备围绝经期大鼠模型，结果发现卵巢切除模型组子宫壁明显变薄，管腔狭窄，黏膜层腺体消失，固有层细胞密集，柱状上皮细胞排列紊乱等病理改变；血清E2的含量、子宫组织ERα和ERβ的表达和子宫系数明显降低。给予玫瑰红芪当归水煎剂干预后，可升高卵巢切除模型组大鼠血清 E2的含量和子宫组织ERα和ERβ的表达，增加其子宫系数，改善其子宫病理形态改变，说明玫瑰红芪当归水煎剂具有雌激素样作用。雌激素主要通过与ERα或ERβ结合，进一步结合雌激素反应元件(Estrogen reflect element，ERE)， 通过AP-1 通路调控基因的转录和表达[12]。ERα的主要作用是促进细胞增殖，是雌激素发挥作用的关键。敲除小鼠的ERα基因研究发现[13]，雌二醇对小鼠的子宫增重作用消失，说明雌二醇通过 ERα起到子宫增重作用。敲除ERα和ERβ的小鼠实验研究中发现[14]，其子宫直径更为狭窄、子宫壁更薄、子宫萎缩程度也更为严重。另有研究证实[15]，活化的ERα能够增加乳腺癌或子宫内膜癌的发病风险，而活化的ERβ则可以抗细胞增殖，说明ERβ在ERα缺失时可直接作用于子宫调节细胞增殖[16]，从而发挥疗效的同时，还能避免雌激素产生的副作用。也有研究发现，植物性雌激素主要结合于β受体，与β受体的亲和力是 α 受体的7～30 倍[17]，相关中药可选择性上调去卵巢大鼠子宫ERα和 ERβ的表达[5]。因此推断，玫瑰红芪当归水煎剂可能通过上调去卵巢大鼠子宫腔上皮和基质中的ERα和 ERβ增加子宫系数和子宫腺体数量，从而改善子宫组织的病理形态改变，从而发挥治疗围绝经期综合征的作用，其具体作用机制尚需进一步研究。