HS-SPME arrow-GC/MS 结合化学计量学分析烟草香气突变体中特征香气成分

徐晓玲，曹建敏，庞雪莉，林樱楠，曹鹏云，刘贯山，孔芳芳，王大海，王德勋，范志勇，邱 军*

1. 中国农业科学院烟草研究所，山东省青岛市崂山区科苑经四路11 号 266101 2. 中国农业科学院研究生院，北京市海淀区中关村南大街12 号 100081 3. 山东潍坊烟草有限公司诸城分公司，山东省潍坊市诸城市密州路37 号 262200 4. 云南省烟草公司大理州公司，云南省大理市下关镇鹤庆路71 号 671000

为创新烟草种质资源，培育优良品种，在烟草基因组计划重大专项的支持下，研究人员采用化学诱变剂处理烟草种子，获得一系列具有特征香韵的烟草高香气突变体材料，经过多年田间鉴定及烤后烟叶感官质量评价，培育了多个具有稳定遗传性状的特征香韵突变品系［1-3］。萨姆逊香突变体材料是其中一种，它是由甲基磺酸乙酯（EMS）诱变烤烟品系中烟100 种子获得的特征香韵材料，其田间长势与中烟100 一致，但烤后烟叶感官质量具有明显的香料烟特征香韵，且质量评价档次较高。烟草高香气突变品系香气特征的表现与其释放的香气成分种类和含量之间存在直接联系［4］。烟草挥发性香气成分组成复杂、含量差异大，高效、灵敏的样品提取方法对烟草特征香气成分的分离分析结果有重要影响。SPME arrow 是一种基于固相微萃取（Solid-phase microextraction，SPME）技术的新装置，近年来得到了日益广泛的应用［5-6］，与常规SPME 相比，其填料量大、吸附性能好、使用寿命长，可显著提高方法灵敏度和样品萃取效率。SPME arrow 在挥发性物质检测中具有样品制备简单，操作方便，测定快速高效，结果稳定性高等优势，已逐渐应用于大气、水和食品等样品的分析［7-9］。目前，关于SPME arrow 在烟草挥发物领域的研究未见报道。因此，本研究中以SPME arrow 技术为基础，以萨姆逊香突变体和中烟100 烤后烟叶为试验材料，采用单因素试验考察了萃取头种类、平衡时间、萃取时间和萃取温度对挥发性香气成分萃取效果的影响，结合GC/MS 非靶标分析技术，建立烟草中挥发性香气成分的检测方法，同时结合PCA 和PLS-DA 等化学计量学手段，揭示萨姆逊香突变体材料的香气物质基础，明确萨姆逊香突变体与对照中烟100 中香气成分的差异，旨在为不同香气风格烟草挥发性香气成分的分析与数据挖掘提供方法参考。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂和仪器

试验材料为2018 年山东省诸城市洛庄试验站种植的特征香韵突变体（萨姆逊香）和对照中烟100（ZY100）的烤后烟叶，等级为C3F，由中国农业科学院烟草研究所生物技术研究中心提供。

α-紫罗兰酮（99%，湖北鸿运隆生物科技有限公司）。

7890A/5975C 气相色谱-质谱联用仪（美国Agilent 公司）；ZZ-SPME-t 固相微萃取加热台（青岛贞正分析仪器有限公司）；FA2004 电子天平（感量0.000 1 g，上海精密科学仪器有限公司）；箭型固相微萃取进样器及4 种SPME arrow 萃取头，包括PDMS（100 μm×20 mm）、CAR/PDMS（120 μm×20 mm）、DVB/PDMS（120 μm×20 mm）、DVB/CAR/PDMS（120 μm×20 mm）（瑞士CTC 分析仪器有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 样品前处理及GC/MS 分析

烤后烟叶样品去除主脉后，剪成细片状，置于烘箱中40 ℃下烘干，磨成烟末，过0.425 mm（40目）筛。准确称取烟末1.0 g，置于20 mL 顶空瓶（配有聚四氟乙烯垫密封盖）中，用微量注射器将α-紫罗兰酮（内标，质量浓度110µg/mL）滴在顶空瓶内侧，密封后置于固相微萃取加热台上平衡；将老化后的萃取头插入顶空瓶中，顶空采样一定时间；从顶空瓶中拔出萃取头并立即插入气相色谱仪进样口，在250 ℃下解吸10 min，进行GC/MS 检测。GC/MS 条件为：

色谱柱：HP-FFAP 石英毛细管（50 m×0.32 mm×0.50 μm）；载气：高纯氦气，流速1.5 mL/min；进样口温度：250 ℃；进样方式：不分流进样；升温程序：初始温度50 ℃，保持1 min，先以10 ℃/min升至130 ℃，再以3 ℃/min 升至200 ℃，最后以5 ℃/min 升至230 ℃，保持20 min；离子源：EI 源；电离电压：70 eV；离子源温度：230 ℃；传输线温度：250 ℃；扫描方式：全扫描；扫描范围：33～600 amu。

1.2.2 数据处理

在提取条件优化数据分析中，对挥发性物质的色谱峰进行自动积分，得到不同条件下烟草挥发性物质的色谱峰数量和总峰面积。为确保方法的可靠性，SPME arrow 提取条件优化部分涉及的色谱峰数量均为化合物峰面积在平行样品间相对标准偏差（RSD）＜30%的有效色谱峰。

经过预实验确认，选择试验样品中不存在且可与其他各组分完全分离的α-紫罗兰酮为内标，采用相对峰面积（各组分峰面积与内标峰面积比值）进行分析。本研究中设置了质控（QC）样品，该样品由试验样品等量混合而成，用于监控整个试验过程。用SIMCA-P13.0 软件筛选出萨姆逊香突变体和对照中烟100 间的差异物质。为消除成分间因含量差异较大而对样本造成的影响，在数据导入前对原始数据进行了标准化处理。对于差异物质的色谱峰，利用美国国家标准与技术局化学数据库（https：//webbook.nist.gov/chemistry/）的标准离子片段进行检索，结合辅助保留指数（Retention index，RI）对比和文献比对等人工解析方式，对差异物质进行鉴定。

2 结果与讨论

2.1 SPME arrow 萃取条件的优化

2.1.1 萃取头种类的选择

烟草中的挥发性物质成分较为复杂，通常包括酸类、醇类、酮类、醛类、酯类、酚类物质等，因此极性和非极性萃取头相结合更适合于此类复杂物质的萃取。在基于常规SPME 方法的烟草挥发性物质检测中，CAR/PDMS 和DVB/CAR/PDMS 萃取头较常用。向章敏等［10］选择PDMS/DVB/CAR 萃取头进行了烟草挥发性生物碱分析。杨琼等［11］选择CAR/PDMS 萃取头对烟气中挥发性和半挥发性成分进行了测定。Tae 等［12］采用SPME arrow 进行糙米醋中挥发物分析时，发现CAR/PDMS 的萃取效果优于其他几种萃取头。

本 研 究 中 选 择PDMS、DVB/PDMS、CAR/PDMS 和DVB/CAR/PDMS 4 种萃取头进行测试，比较了不同材质萃取头对烤后烟叶挥发性香气成分选择性和重现性的影响。从图1 可以看出，不同吸附涂层的纤维头对烟叶挥发性香气成分的分析结果影响较大，4 种萃取头中CAR/PDMS 萃取头的色谱峰数量和总峰面积都明显高于其他3 种萃取头。可见，CAR/PDMS 在烟草挥发性物质检测中萃取物质种类多，灵敏度高。因此，选择CAR/PDMS 为吸附萃取头。

图1 4 种SPME arrow 的萃取效果比较Fig.1 Comparison of extraction effects among four SPME arrows

2.1.2 平衡时间的确定

平衡时间不仅可以决定挥发性成分和样品之间的两相平衡效果，还影响萃取头的吸附量和达到吸附平衡的时间［13］。为进一步优化SPME arrow的平衡时间，选择萃取效果较好的CAR/PDMS 作为吸附萃取头，固定萃取时间为30 min，萃取温度为70 ℃，考察了平衡时间（10、20、30、40、50、60、70 min）对萃取效果的影响。结果（图2）显示，当平衡时间达到40 min 时，色谱峰数量和总峰面积趋于稳定，再延长平衡时间二者变化不大，因此确定平衡时间40 min。

图2 不同平衡时间的萃取效果比较Fig.2 Comparison of extraction effects at different equilibrium times

2.1.3 萃取时间的确定

为进一步优化SPME arrow 的萃取时间，固定CAR/PDMS 为吸附萃取头，平衡时间为40 min，萃取温度为70 ℃，考察了萃取时间（10、20、30、40、50、60、70 min）对萃取效果的影响。由图3 可知，随着萃取时间的延长，色谱峰数量和总峰面积也随之增大，在40 min 后趋于平缓，说明物质吸附和脱附之间达到平衡。当萃取时间为70 min 时，总峰面积略有下降，这可能是因为萃取头涂层吸附已经趋于饱和，萃取时间过长会导致热稳定性差的物质分解或者少量易挥发性组分逸出，进而造成物质损失，使总峰面积减小。因此，确定萃取时间为40 min。

图3 不同萃取时间的萃取效果比较Fig.3 Comparison of extraction effects at different extraction time

2.1.4 萃取温度的选择

萃取温度的高低直接影响目标物的吸附效果［14］。温度过低会使平衡时间变长，萃取的挥发性成分的数量和种类也较少。当温度升高时，挥发出来的物质种类和数量增加，但是温度过高时，一方面，会导致平衡蒸汽压增大，分子热运动加快，吸附平衡系数降低，物质吸附量减少［15］，另一方面，会使萃取头上热稳定性差的物质发生解析，吸附量减少。Feng 等［16］研究表明，低分子量的挥发性物质，包括乙醇和乙酸乙酯，由于分配系数较低，在较高温度下峰面积较小。另外，当温度超过100 ℃时，烟末中的糖类物质和氨基酸之间会发生美拉德反应，生成其他产物［17］，影响定性分析结果。因此，在烟草挥发性物质分析中，萃取温度一般都不超过100 ℃。

为进一步优化SPME arrow 的萃取温度，固定CAR/PDMS 为吸附萃取头，平衡时间为40 min，萃取时间为40 min，考察了萃取温度（40、50、60、70、80、90、100 ℃）对萃取效果的影响。结果（图4）显示，随着温度的升高，总峰面积不断增加，但有效色谱峰数量呈现先上升再下降的趋势，在温度升至70 ℃后不断降低，说明温度超过70 ℃后，挥发性物质不稳定，样品间重现性变差。综合考虑，选择萃取温度为70 ℃。

2.2 方法学评价

HS-SPME arrow-GC/MS 测定和多元统计分析中，重现性为方法稳定性的主要考察指标之一。连续6 d，采用优化的方法检测QC 样品，对方法的重现性进行考察。从QC 样品中共检测到178个色谱峰。所有色谱峰保留时间的相对偏差均在±0.03 min 内，说明保留时间稳定，有利于自动积分。在178 个色谱峰中，峰面积RSD＜10%、10%～20%、20%～30%的色谱峰个数分别为74、62 和23个。159 种化合物色谱峰相对峰面积的RSD＜30%，占色谱峰总数量的89.3%。

图4 不同萃取温度的萃取效果比较Fig.4 Comparison of extraction effects at different extraction temperatures

2.3 烟草香气突变体特征香气成分解析

2.3.1 香气成分PCA 分析

将数据导入SIMCA-P13.0 软件，变量经Par-scaling 标度化处理后，采用非监督模式识别方法（PCA）观察各样本的总体分布情况。PCA 可以尽可能多地反映变量的原始信息，直观显示不同样本之间的整体差异，从得分图（图5）可以看出，QC 样本紧密聚集，说明试验过程中，检测方法和仪器状态稳定，对结果影响较小。萨姆逊香突变体与中烟100 可以自然聚集为两类，说明两个样品间香气物质存在一定差异。

图5 香气成分PCA 得分图Fig.5 PCA score plot of aroma components

2.3.2 香气成分PLS-DA 分析及特征香气成分解析

为进一步研究萨姆逊香烟草突变体与对照中烟100 之间香气成分的差异，采用有监督的模式识别方法最小二乘判别分析（PLS-DA），对两个材料烟叶的挥发性香气成分进行分析，分析结果见图6。由图6 可以看出，两组样品聚类良好，可显著分离。结合评价PLS-DA 模型质量的3 个关键指标可知，R2X=0.691，R2Y=0.991，Q2=0.966，说明模型的稳定性和预测性较好。此外，为了验证模型是否存在过拟合现象，本研究中还对模型进行了200次响应排序（图7）。排列实验中左端任何一次随机排列产生的R2、Q2值均小于右端的原始值，Q2截距值等于或小于0，则表明模型有效。由图7 可知，R2和Q2的截距分别为0.614 和-0.146，说明模型有效，不存在过拟合现象。

图6 香气成分PLS-DA 得分图Fig.6 PLS-DA score plot of aroma components

图7 PLS-DA 模型200 次交叉检验验证图Fig.7 Cross-validation plot of PLS-DA with 200 permutation tests

表1 萨姆逊香突变体和中烟100 的差异挥发性成分Tab.1 Differential volatile compounds between Samson and ZY100

采用变量权重重要性排序（Variable Importance in Projection，VIP），结合T-检验的P值（阈值为0.05），对PLS-DA 模型中差异性较大的代谢物进行筛选。以VIP＞1.0 为标准，筛选了对模型分类贡献较大的33 个变量（表1）。VIP 值越大，说明香气成分在两个样本间的差异越显著。差异倍数（fold change，FC）为香气成分在萨姆逊香突变体和中烟100 中相对含量的比值，P值由T-检验获得。由表1 可知，33 种差异代谢物中包含酮类10种，酸类7 种，醇类4 种，醛类3 种，酯类2 种，其他类别化合物7 种。其中，萨姆逊香材料中绝大部分物质的含量高于中烟100，中烟100 中仅有4 种化合物（乙酸、苯甲醛、十六酸甲酯、二烯烟碱）的含量高于萨姆逊香突变体。

萨姆逊香突变体具有明显的香料烟特征香韵，烟叶具有浓郁芳香、吃味醇和等特点。研究表明，香料烟的挥发性有机酸对烟叶的香气贡献较大［18］，香料烟中β-甲基戊酸、戊酸和异戊酸的含量比烤烟中高，其香气强度明显高于其他挥发性有机酸，而甲酸和乙酸的含量则相对较低［19］。本研究中筛选出7 种差异显著的有机酸，其中，乙酸含量降低，而β-甲基戊酸、戊酸、己酸等6 种有机酸的含量均升高，这与香料烟的特性相符合。在酮类挥发性香气成分中，茄酮、降茄二酮、β-二氢大马酮和β-大马酮等重要香气物质的含量显著升高。茄酮及其降解产物降茄二酮是烟草重要的香味物质，其香气与烟香协调，可赋予烟气类似胡萝卜的香味以及甘草香和茶香，在提高卷烟香气质、香气量等方面发挥着重要作用［20］。萨姆逊香材料中β-大马酮含量是中烟100 的4.78 倍，β-大马酮是类胡萝卜素的主要降解产物，属于中性致香物质［21］。苯甲醛和糠醛是烟草中两种重要的醛类香气物质，二者分别属于苯丙氨酸类代谢产物和棕色化反应产物，与中烟100 相比，萨姆逊香突变体中苯甲醛含量极显著降低，而糠醛含量极显著增加，这与常爱霞等［21］对烤烟和香料烟中挥发性致香物质的研究结果一致。此外，与对照中烟100 相比，萨姆逊香突变体中4 种醇类物质（5-甲基-2-呋喃甲醇、8-羟基芳樟醇、苯甲醇和环己醇）的含量均极显著增加。可见，萨姆逊香突变体烟叶中香气物质的组成、含量及各组分之间的平衡协调性综合影响了烟叶的香气特征。

表1（续）

3 结论

通过对影响SPME arrow 萃取效率的4 个主要因素（萃取头涂层种类、平衡时间、萃取时间和萃取温度）进行优化，建立了一种基于HS-SPME arrow-GC/MS 测定烟草挥发性香气成分的方法。本方法具有简单、可靠，灵敏度高，重现性较好等特点，可用于批量样品的检测与分析，尤其适合于低分子量挥发性香气成分的分析。将本方法与化学计量学相结合，分析了萨姆逊香突变体和中烟100 烟叶中香气成分的差异，从两个材料中鉴定出包括酮类、酸类、醇类、醛类、酯类物质等33 种差异香气组分。两种不同香气特征的烟叶在模型中实现了显著分离，香气成分差异显著。