烟草查尔酮异构酶基因2（NtCHI2）功能分析

翟 妞，郑庆霞，刘萍萍，徐国云，张 慧，李 晶，陈千思，武明珠，周会娜*

1. 中国烟草总公司郑州烟草研究院，郑州高新技术产业开发区枫杨街2 号 450001 2. 云南中烟工业有限责任公司技术中心，昆明市五华区科医路41 号 650106

黄酮类化合物是一种小分子酚类物质，是植物次生代谢的主要产物之一，具有调节植物生长、保护植物免受紫外线损伤、抗病虫、抗氧化等功能［1-2］。烟草黄酮类化合物不仅对烟株生长发育起重要作用，该类化合物，尤其是其中的芸香苷含量对烟叶品质有直接影响［3-4］。目前黄酮类化合物的代谢途径相对清楚，黄酮类代谢起始于苯丙烷代谢，由查尔酮合成酶（Chalcone synthase，CHS）引向黄酮类合成［5-6］。查尔酮异构酶（Chalcone isomerase，CHI）是黄酮类合成代谢的一个关键节点酶［7］，在黄酮类物质的代谢通路中催化查尔酮柚（苷）配基4，5，7-三羟黄烷酮转化合成柚（苷）配基4，5，7-三羟黄烷酮（异黄酮的前体），由此进入异黄酮代谢支路［8-9］，芸香苷就是此支路的产物。贾宏昉等［10］的研究表明，CHI基因在不同生态区浓香型烤烟中的表达差异明显，提示其可能在黄酮类物质形成中起关键作用。栽培烟草中的CHI基因有2 个拷贝，即NtCHI1和NtCHI2，NtCHI1的功能已经验证过［11］，NtCHI2的功能还未见报道。

本课题组前期多组学关联分析发现，鲜烟叶中芸香苷的含量与NtCHI2正相关，相关系数为0.72。本研究中以NtCHI2过表达和干扰株系为研究对象，通过qPCR 定量分析基因NtCHI2的表达，进一步结合体内体外查尔酮异构酶活性分析和体内芸香苷含量测定，验证NtCHI2基因的功能，为芸香苷的合成代谢调控提供新靶标，也为创制新型烟草材料提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂和仪器

1.1.1 烟草材料

NtCHI2（Ntab0103790.1）过表达转基因株系（CHI-1、CHI-2、CHI-3）和干扰株系（RNAi-1、RNAi-2、RNAi-3、RNAi-4、RNAi-5）为本实验室前期构建，对照株系（CK）为K326，温室培育；8～10 叶期时，采集第4 片叶，立即液氮冷冻，-80 ℃保存。

1.1.2 试剂

RNApre pure 植物总RNA 提取试剂盒购自北京天根生物技术有限公司；第一链合成反转录试剂盒购自美国Roche 公司；荧光定量试剂盒FastStart Universal SYBR Green Master 购自美国Roche 公司；蛋白定量试剂盒Pierce ™ BCA Protein Assay Kit 购自美国Thermo 公司；查尔酮异构酶活性检测试剂盒购自上海晶抗生物科技有限公司；引物由擎科生物（郑州）工程有限责任公司合成；其他常规试剂均为购自中国医药集团有限公司的分析纯试剂。蛋白提取NE 缓冲液，实验室自配（20 mmol/L Hepes（pH 7.5），40 mmol/L KCl，1 mmol/L EDTA，1 mmol/L PMSF）。甲酸、乙腈、无水乙醇（色谱纯，美国Merck 公司）；标准品（山奈酚、绿原酸、东莨菪亭、东莨菪苷、花青素鼠李糖苷、芸香苷、山奈酚-3-糖、槲皮素和鼠李金）购自美国Sigma-Aldrich 公司。

1.1.3 仪器

PL-602L 和MS105 电子天平（瑞士Mettler Toledo 公司）、PURELAB Pulse 超纯水一体化系统（英国ELGA 公司）、FRESCO 21 冷冻台式离心机（美国Thermo 公司）、Nanodrop 2000 超微量分光光度计（美国Thermo 公司）、PCR System 9700 热循环仪（美国AB 公司）、MK2000-2E 恒温金属浴（杭州奥盛仪器有限公司）、LightCycler®96 实时荧光定量PCR 仪（美国Roche 公司）、Spectra Max plus 384 酶标仪（美国MD 公司）、1290/6490 超高效液相色谱/三重四极杆串联质谱联用仪（美国Agilent 公司）、25 EL5 冷冻干燥机（美国Genesis公司）。

1.2 方法

1.2.1 烟草叶片RNA 提取及cDNA 制备

将烟叶样品在液氮中充分研磨后，取10 mg 粉末，参考张慧等［12］的方法进行RNA 的提取和cDNA 的制备。

1.2.2 实时荧光定量PCR（qPCR）

qPCR 反 应 条 件：95 ℃10 min；95 ℃10 s，55 ℃10 s，72 ℃10 s，共40 个 循 环；95 ℃5 s，65 ℃1 min，以0.1 ℃/s 升温至97 ℃。

以β-actin为内参基因，内参基因和目的基因各重复3 次，结果以平均值表示。每个样品组的目的基因NtCHI2/内参基因β-actin的比值代表基因的表达水平变化。内参基因β-actin，正向引物：5'-CT GGCATTGCAGATCGTATA-3'；反向引物：5'-GCGCC ACCACCTTGATCTT-3'。目的基因NtCHI2，正向引物：5'-GATTCAATTACTGGCACTC-3'；反向引物：5'-TCGGCGATACTACACTTT-3'。具体qPCR扩增体系及计算参考张慧等［12］的方法。

1.2.3 烟草叶片总蛋白提取及定量

1.2.3.1 蛋白提取

将采集的烟叶样品在液氮中充分研磨，称取100 mg 粉末，加入1 mL 全蛋白提取缓冲液NE；参考翟妞等［13］的方法进行烟叶全蛋白的提取。

1.2.3.2 蛋白定量

取上清液，稀释10 倍，按照BCA 蛋白浓度测定试剂盒说明进行实验。根据所测样品的吸光值，依据标准曲线获得相应的蛋白质量（μg），除以样品稀释液总体积并乘以样品稀释倍数即为样品实际浓度（μg/μL）。

1.2.4 查尔酮异构酶活性检测

每个株系采集第4 叶位叶片，按照查尔酮异构酶活性检测试剂盒说明书进行检测。3 次重复，对结果进行T检验分析。

查尔酮异构酶活性（U/μg 全蛋白）=样品的活性浓度×上样体积/上样蛋白总量

1.2.5 查尔酮异构酶体外表达活性检测

利用本实验室已构建好的体外表达质粒pQE30-NtCHI2，转化BL21 细胞，挑取单克隆菌斑置入150 mL 锥形瓶中，37 ℃180 r/min 恒温培养，至OD 值为0.6～1.0 时，0.5 mol/L IPTG 诱导表达，37℃180 r/min 恒温培养3 h。收集菌液，4 000 r/min 4 ℃离心10 min，弃上清液，加入蛋白裂解液RIPA 5 mL，混匀后冰上超声提取，13 000 r/min 离心15 min，取上清液，利用1.2.4 节的方法进行酶活性测定。

1.2.6 芸香苷含量检测

取烟叶冻干粉末20 mg 于2 mL 离心管中，加入1.5 mL 提取液（75%甲醇溶液，含内标伞形花内酯，质量分数为2.5 mg/mL），涡旋6 s后超声提取1 h后，12 000 r/min 离心15 min，取上清液，参考刘萍萍等［14］的方法测定芸香苷含量。6 次检测重复，对结果进行T-test 差异显著性分析。

2 结果与分析

2.1 查尔酮异构酶基因过表达株系和干扰株系中NtCHI2 的表达量

对实验室培育的NtCHI2过表达株系和干扰株系的叶片样品进行定量分析，结果（图1）发现：和对照株系比，过表达株系中NtCHI2的表达量增加5 倍至75 倍（图1a），基因表达上调显著；和对照株系比，干扰株系中NtCHI2的表达量下降约30%～70%（图1b），基因表达下调极显著。

图1 NtCHI2 在过表达株系（a）和干扰株系（b）中的表达差异Fig.1 Relative expression levels of NtCHI2 in NtCHI2-OE（a）and NtCHI2-RNAi（b）strains

2.2 查尔酮异构酶基因过表达株系和干扰株系中CHI 的活性

对NtCHI2过表达株系和干扰株系的叶片样品在基因定量的基础上，进行CHI 的酶活检测。结果（图2）发现，和对照株系比，NtCHI2过表达株系中CHI 酶的活性没有显著差异（图2a），而干扰株系中CHI 酶的活性显著降低，各株系分别降低34.2%、57.6%、46.8%、51.4%和61.6%（图2b）。说明在烟草中过表达NtCHI2对CHI 酶活的影响不大，而降低NtCHI2基因表达量则会显著降低CHI酶的活性。

图2 NtCHI2 过表达株系（a）和干扰株系（b）中CHI 的活性差异Fig.2 CHI activities of NtCHI2-OE（a）and NtCHI2-RNAi（b）strains

2.3 体外表达查尔酮异构酶的活性

通过构建好的表达菌株pQE30-CHI2/BL21 诱导表达CHI2 蛋白，提取全蛋白进行CHI 酶活性检测。结果（图3）表明：体外表达CHI2 的酶活性为1.4×10-4U·μg-1全蛋白，而空载体对照几乎为零。说明烟草NtCHI2的表达产物具有CHI 酶活性。

图3 NtCHI2 表达菌株中CHI 酶的活性Fig.3 CHI activity of strains with NtCHI2 expression

2.4 查尔酮异构酶基因过表达株系和干扰株系中芸香苷含量

对实验室培育的NtCHI2过表达株系和干扰株系的叶片样品在基因定量和酶活性检测的基础上，进行芸香苷含量检测。结果（图4）发现：和对照株系比，NtCHI2过表达株系中芸香苷的含量变化不明显（图4a），而干扰株系中芸香苷的含量显著降低，不同株系可分别降低90.5%、72.4%、91.3%、88.8%和85.4%（图4b）。说明干扰株系中，NtCHI2的表达量降低，对应的CHI 酶的活性也随之降低，影响了后续的黄酮类化合物芸香苷的代谢。

图4 NtCHI2 过表达株系（a）和干扰株系（b）中芸香苷的含量差异Fig.4 Rutin contents in NtCHI2-OE（a）and NtCHI2-RNAi（b）strains

3 讨论

本研究中发现NtCHI2的表达量与鲜烟叶中芸香苷的含量正相关。但是与NtCHI1比，NtCHI2过表达株系中，CHI 活性和芸香苷含量没有变化，不过体外实验（图3）表明NtCHI2的体外表达产物确实具有CHI 酶活性。

NtCHI2与NtCHI1功能的差异，可能由以下原因引起：①NtCHI1由603 个核苷酸组成，NtCHI2由768 个核苷酸组成，均含有4 个外显子，NtCHI23'端 比NtCHI13' 端 多165 个 核 苷 酸；②NtCHI1 由200 个氨基酸组成，NtCHI2 由255 个氨基酸组成，NtCHI2 C 端比NtCHI1C 端多55 个氨基酸；③搜索中 国 烟 草 基 因 组 数 据 库（http：//10.6.0.76/）中NtCHI1 和NtCHI2 的结构信息，NtCHI1 的活性功能域为6～199 位的氨基酸，NtCHI2 的活性功能域为6～206 位的氨基酸，NtCHI2 比NtCHI1 多7 个氨基酸，为TIPEIGV。NtCHI2过表达株系中，CHI 活性没变化，应该和其结构域中多出的7 个氨基酸有关。NtCHI2翻译后的氨基酸修饰，抑制其CHI活性，与芸香苷引发的反馈抑制无关，因为芸香苷的含量并没有增多。但具体是哪个氨基酸被修饰引起的NtCHI2 酶活性被抑制，需要后续实验证实。

对NtCHI2功能的进一步验证，确定其关键结构域中起关键作用的氨基酸，可以为后续通过分子手段干扰、定点突变等调控芸香苷代谢提供精确靶点。对比其他通过栽培手段提高CHI 酶活性［15］或者利用转录因子调控关键酶基因的转录等［16-19］调控类黄酮代谢技术，通过分子手段对类黄酮代谢关键酶CHI 的活性进行靶向调控更为直接，效果也可能更好。

4 结论

NtCHI2表达蛋白具有查尔酮异构酶活性；过表达株系中，NtCHI2表达量明显增加，但CHI 酶的活性和芸香苷的含量基本没有变化；NtCHI2干扰株系中，NtCHI2表达量显著降低，CHI 酶的活性和芸香苷含量也显著降低。因此，NtCHI2基因表达量与烟叶芸香苷含量具有一定的正相关关系，可通过抑制NtCHI2基因的表达进而提高烟叶中芸香苷的含量。