金复康口服液对Lewis肺癌荷瘤小鼠PD-1、PD-L1表达及相关免疫因子的影响*

贾 方，王秋月，崔文静，张 轶，王菊勇

上海中医药大学附属龙华医院(上海 200032)

肺癌是世界上最常见的恶性肿瘤之一，2018年全球肺癌新发病例约209万例，死亡约176万例，分别占恶性肿瘤新发病例11.6%和死亡病例18.4%，居恶性肿瘤第一位[1]。近年来研究者发现程序性死亡受体-1(Programmed death receptor 1,PD-1)及其配体(Programmed death ligand 1,PD-L1)参与肿瘤细胞的免疫逃逸，PD-1/PD-L1信号通路在肺癌细胞中异常表达，表明其与肺癌发生发展及抗肿瘤负调节免疫反应有密切关系。金复康口服液是上海中医药大学附属龙华医院、国医大师刘嘉湘先生的临床实践总结并研制而成，在治疗肺癌方面具有良好的疗效及安全性[2]。本研究将 Lewis 肺癌细胞移植瘤小鼠为动物模型，研究金复康口服液对荷瘤小鼠抑瘤作用，并从调节PD-1、PD-L1表达及免疫相关因子方面对其提高免疫功能抗肿瘤作用进行探讨。

材料和方法

1 实验材料

1.1 实验动物和细胞株：近交系C57BL/6小鼠，6～8周，无特殊病原体，雄性，体质量(20±2)g,32只；动物级别SPF级，购自上海灵畅生物科技有限公司，实验动物合格证号为SCXK(沪)2018-0003。饲养于上海中医药大学动物房，室温为25 ℃，湿度为70%，自由摄食和饮水。小鼠Lewis肺癌细胞株由中国科学院细胞库提供，使用10%胎牛血清(FBS)及1%青霉素/链霉素的达尔伯克改良伊格尔培养基(Dulbecco’s modified eagle medium，DMEM)，于37 ℃、5%CO2饱和湿度培养箱中培养。

1.2 主要试剂和仪器：金复康口服液由吉林三九金复康药液有限公司提供，每毫升含1 g生药(批号：181001)。注射用顺铂(冻干型)(国药准字 H20023461)，上海中医药大学附属龙华医院西药房提供，用生理盐水稀释至0.734 mg/ml。DMEM (Hyclone),PBS(天津灏洋),胰蛋白酶、青霉素-链霉素溶液(Hyclone)，胎牛血清(Gibco),BCA蛋白定量试剂盒(碧云天)，10%凝胶试剂盒(雅酶),ECL 超敏发光试剂盒(碧云天),兔抗小鼠PD-1/PD-L1单克隆抗体(Abcam),HRP标记的二抗(arigo),RNA提取试剂盒(EZBioscience生物)，DNA引物(上海生工生物工程有限公司),TAKARA_RR047A PrimeScript RT reagent Kit，TAKARA_RR420A TB Green Premix Ex Taq，ELISA检测试剂盒(司鼎生物),电子天平(BSA623S赛多利斯科学仪器有限公司)MCO-18AIC CO2细胞培养箱(SANYO，日本)、MSC-Advantage生物安全柜(Thermo Fisher，美国)，低速台式离心机(上海安亭科学仪器厂)，DMI3000B倒置显微镜购(Leica德国)，组织研磨仪(必横生物) GelDoc XR凝胶成像系统(Bio-Rad，美国)Mini-PROTEANRTetra蛋白垂直电泳系统(Bio-Rad，美国)，EC3410化学发光成，像系统(UVP，美国)，Nano Drop 2000C超微量分光光度计(Thermo Fisher，美国),Step One Plus荧光定量PCR(ABI，美国),infinite F200多功能酶标检测仪(TECAN，瑞士)。

2 实验方法

2.1 造模及分组:采用对数生长期Lewis肺癌细胞，将细胞数调整为1×107个/ml。用 1 ml注射器吸取Lewis细胞悬液0.2 ml(含细胞数2×106个)注射于C57BL/6小鼠右腋部皮下，完成小鼠皮下移植瘤的接种。 造模后随机将小鼠分为四组且每组8只，分别为模型组和金复康低、中、高剂量组。给药方式：模型组给予生理盐水0.2 ml，金复康低剂量组为15 g/kg，金复康中剂量组为30 g/kg，金复康高剂量组为60 g/kg，均为每日灌胃1次,连续14 d。

2.2 小鼠移植瘤质量，计算抑瘤率：第14天小鼠脱颈椎处死并取肿瘤组织，用电子天平称量瘤体质量，计算抑瘤率。抑瘤率(%)=(模型组平均瘤质量-治疗组平均瘤质量)/模型组平均瘤质量×100%。

2.3 荧光定量PCR检测肺癌小鼠肿瘤组织PD-1/PD-L1 mRNA的含量：随机取肿瘤组织20 mg，每组4个，使用组织研磨仪研磨，制备细胞悬液。根据组织RNA提取试剂盒提取，然后超微量分光光度仪测各样本浓度(吸光度值260/280≈1.8)。参照逆转录酶说明书进行反转录。根据目的基因cDNA序列，用Primer 5.0软件设计引物,序列见表1。采用荧光定量PCR法，反应体系为20 μl。扩增条件：95 ℃2 min变性后，95 ℃变性15 s，60 ℃退火30 s，循环40次。PD-1(PD-L1)/GAPDH比值采用 2-△△Ct法计算目的基因相对表达水平。见表1。

2.4 Western blot法检测肺癌小鼠肿瘤组织PD-1/PD-L1 蛋白表达水平：提取各组小鼠肿瘤组织的蛋白，配胶后经电泳蛋白分离后，将蛋白转印于PVDF 膜上，5%脱脂奶粉摇床上封闭1 h，加入兔单克隆PD-1抗体、PD-L1 抗体(1∶1000)，4 ℃孵育12 h。TBST洗涤4次，8 min/次，而后加二抗即山羊抗兔IgG(1∶10000)，室温孵育1 h，TBST洗涤4次，8 min/次。使用化学发光显像系统曝光，后用Image J蛋白分析软件分析，结果取相对平均表达量。

表1 引物序列

2.5 肺组织切片HE染色：石蜡包埋肺组织，每个标本切取三张片子，常规脱蜡至水，苏木素染1 min自来水冲洗1 min，盐酸酒精3 s,流水冲洗5 min,伊红染色10 s，梯度酒精上行脱水，二甲苯透明Ⅰ、Ⅱ各20 min,中性树胶封片，光学显微镜下观察。

2.6 小鼠血清中IFN-γ和 IL-12检测：从给药开始第14天，将Lewis肺癌小鼠异氟烷麻醉后摘眼球取血，离心分离血清(7000 rpm×5 min)。按照IFN-γ和 IL-12 试剂盒说明书操作，将酶标仪设置450 nm检测各孔吸光度并计算IFN-γ和IL-12水平。

结 果

1 金复康口服液对Lewis肺癌小鼠的抑瘤作用见表2。在接种Lewis 肺癌细胞约3 d左右，荷瘤对照组和低剂量组可触及皮下结节，而后逐渐增大，中药中、高剂量组约5 d左右触及皮下结节，其中，金复康中、高剂量组生长较缓慢。各组的抑瘤结果显示：中药中、高剂量组抑瘤作用明显，与模型组相比差异具有统计学意义(P<0.05)。

表2 各组小鼠肿瘤质量及抑瘤率比较

2 金复康口服液对小鼠肿瘤组织中 PD-1及PD-L1 mRNA表达水平的影响 见表3。与模型组相比，低、中、高剂量组进行单因素方差分析，结果显示金复康口服液中、高剂量组降低PD-L1 mRNA的表达，差异具有统计学意义(P<0.05)；低剂量组能升高PD-1 mRNA的表达，中、高剂量组降低PD-1 mRNA的表达,差异具有统计学意义(P<0.05)。

表3 金复康口服液对肿瘤组织中

3 金复康口服液对小鼠肿瘤组织 PD-1 及PD-L1 蛋白表达水平的影响 见表4。与模型组比较，金复康口服液中、高剂量组对PD-1、PD-L1 的表达均具有统计学意义(P<0.05)；与低剂量组比较，金复康口服液中剂量组对PD-1的表达差异具有统计学意义(P<0.05)，高剂量组对PD-L1的表达差异具有统计学意义(P<0.05)。结果提示，金复康口服液能够降低肿瘤组织PD-1及PD-L1表达。

表4 金复康口服液对小鼠肿瘤组织中PD-1及PD-L1

4 金复康口服液对小鼠肺组织病理学的影响 模型组和低剂量组可观察细胞形态大小不一且排列不规则，有明显癌巢，细胞分化差，核大深染，多见核分裂相，且肺组织形态破坏严重；中剂量、高剂量组则肺泡形态较好，肺组织形态完整，未见明显癌巢，细胞形态均一、分化较好(图1)。

5 金复康口服液对小鼠血清中相关免疫因子(IFN-γ、IL-12)的作用 见表5。中、高剂量组与模型组比较IFN-γ均上升，且中剂量与低剂量组比较IFN-γ升高差异有统计学意义(P<0.05)；中剂量组与模型组比较IL-12上升差异有统计学意义(P<0.05)，而金复康口服液高剂量组IL-12 与模型组比较，差异无统计学意义(P>0.05)。表明金复康口服液能够提高荷瘤宿主血清IFN-γ、IL-12的含量。

图1 各组小鼠肺组织病理学表现(HE染色，×200)

表5 金复康口服液对小鼠血清中IFN-γ、IL-12的作用

讨 论

机体在正常状况下出现肿瘤细胞时，能够通过免疫监视产生免疫应答杀死肿瘤细胞。肿瘤细胞通过上调免疫抑制细胞或下调免疫激活细胞抑制免疫应答，促使其发生免疫逃逸。PD-1(CD279)在人类和小鼠活化的T、B细胞、调节性T细胞(Tregs)、树突状细胞(Dendritic cells,DC)及单核细胞等免疫细胞中表达[3-4]。配体PD-L1 主要在肿瘤细胞和抗原呈递细胞(APC)上表达[5-6]。PD-1与PD-L1的相互作用发生在肿瘤微环境中。激活PD-1及PD-L1信号通路可形成免疫抑制性肿瘤微环境[7-8]，故而阻断该通路则可逆转肿瘤免疫微环境，增强机体免疫细胞的杀伤能力,从而改善恶性肿瘤患者预后情况[9]。研究显示在非小细胞肺癌、乳腺癌、胃癌、黑色素瘤等恶性肿瘤中PD-L1表达升高，并与这些肿瘤的不良预后相关[10]。PD-1及PD-L1信号通路已经成为免疫检查点治疗新靶点，是调节非小细胞肺癌T细胞反应的关键抑制途径。故而探索阻断PD-1及PD-L1信号通路的中药复方，从而提高免疫功能，改善肿瘤免疫环境。

肺癌属中医“肺积”“息贲”“痰饮”等病的范畴。《医宗必读》谈到“积之成也，正气不足，而后邪气踞之。”“正气”指机体对致病因素的防御和抵抗能力，与西医学的免疫功能有异曲同工之意。非小细胞肺癌的发生、发展与肿瘤的免疫逃逸机制密切相关。金复康口服液主要由黄芪、北沙参、淫羊藿、绞股蓝、石上柏、重楼等十二味中药组成，以益气养阴、补肾培本等扶正药物为主，主要针对非小细胞肺癌气阴两虚证，其通过增强人体抗病能力，达到控制或缩小肿瘤的目的。临床研究表明金复康口服液可提高非小细胞肺癌患者生存率，改善临床症状，抑制肿瘤复制、侵袭及转移，增加化疗疗效，减轻毒副作用[11-12]。实验研究表明金复康口服液能够提高NK、LAK、IL-2的水平[13]，诱导循环肿瘤细胞衰老[14]，调节肺癌Th1、Th2失衡等[15]。本研究拟从PD-1及PD-L1角度研究金复康口服液提高免疫细胞抗肿瘤的作用。

本研究发现金复康口服液对肺癌移植瘤及肺转移具有一定的抑制作用。从mRNA和蛋白水平而言，金复康口服液能够显著降低肿瘤组织 PD-1及PD-L1 水平，以中、高剂量组效果较好，且升高血清中免疫因子IFN-γ、IL-12的表达含量，提示一定剂量的金复康口服液在荷瘤小鼠体内可能通过抑制肿瘤中PD-1及PD-L1 水平，恢复CTL细胞活性从而增强淋巴细胞对肿瘤杀伤能力，同时增加炎症细胞因子的分泌，发挥免疫调节抗肿瘤作用。这为我们接下来进一步研究金复康口服液调节免疫微环境抗肿瘤的分子机制奠定了一定的基础。