铁及铁死亡在肺癌方面的研究近况

俞华林，李鹏飞，汪丽，张春，杨劲松

(1.南京医科大学附属南京医院(南京市第一医院)肿瘤内科,南京260000; 2.南通大学附属医院眼科,江苏 南通226001)

随着技术信息时代的不断革新，越来越多的疾病及其发生发展机制被重新认识，肿瘤便是当前急需被更深层次挖掘的一大类疾病。肿瘤治疗方案的不断更新为解决民生问题提供了重要保障，其中肺癌的研究不断取得新突破，为人类带来了新希望。肺癌是全世界范围内癌症相关性病死率的主要原因，降低肺癌患者病死率不仅提高了人们战胜更多疾病治疗的信心，也将加快人类医药历史进步的新步伐[1]。肺癌及支气管癌仍然是美国癌症-死亡的主要原因，近10年，转移性非小细胞肺癌患者总生存率不到5%，可见解决肺癌的治疗问题仍是全人类的一大难题[2]。虽然目前有关肺癌发生发展的机制尚未完全明确，但是肺癌的高复发性预示了其预后极差，因此更好地了解有关肺癌发生发展机制将有助于指导临床治疗[3]。当前备受研究者们关注的一方面是人体微量元素：铁及其所参与的各种代谢过程；另一方面是一种新的细胞死亡模式，铁死亡。有关铁死亡的研究早在20世纪末就有报道，但目前关于肺癌铁死亡的研究甚少。现就铁、铁代谢及铁死亡在肺癌中的研究进展予以综述。

1 铁在机体的正常代谢

人体的正常生长离不开各种微量元素的调节，铁是最重要的膳食元素之一。许多重要的生物过程中均需要铁，包括氧转运(血红蛋白中的血红素)、DNA生物合成(作为核糖核苷酸还原酶的辅助因子)和ATP生成(作为柠檬酸循环和电子转运链中许多蛋白质的辅助铁因子)。铁具有氧化还原活性，可产生活性氧类(reactive oxygen species，ROS)，导致氧化应激并启动对于细胞存活和细胞死亡至关重要的信号通路。

西方人每天摄入铁20～30 mg，中国人每天摄入铁10～15 mg。食物中含血红素铁(有机)和非血红素铁(无机)，血红素铁在铁总量中所占比例较小，主要存在于红肉中，由于铁盐的不溶性，其较非血红素铁更易被人体吸收(15%～40%)[4]。此外，血红素铁可以作为一种亚硝化参与致癌过程，形成已知的致癌物质n-亚硝基化合物，进一步说明食用过量红肉的致癌性[5]。非血红素铁是铁总量的主要组成部分，主要存在于谷类、豆类和一些蔬菜中。人体对铁的吸收主要受体内铁储存量、缺氧和促红细胞生成素活性的影响[6]。维生素C能够极大地增强非血红素铁的吸收，而钙对两种形式的铁的吸收均起作用[7]。

机体铁代谢稳态包括铁摄入、储存及转运的动态平衡稳态。维持机体铁代谢稳态物质有铁蛋白、运铁蛋白、运铁蛋白受体1、二价金属离子转运体1、运铁素(唯一已知的细胞铁外排泵)、铁调素等。白细胞介素-6和脂质-2是目前研究较为明确的在铁储存及转运稳态中起作用的物质[8]。

非血红素铁在铁还原酶(如十二指肠细胞色素B还原酶)的作用下，在肠腔内由Fe3+还原为Fe2+，并通过二价金属离子转运体转运至肠细胞。而血红素铁是通过一种机制尚不明的方式被肠道细胞所吸收，并由血红素加氧酶1代谢，释放Fe2+。通过体外吸收的铁是由膜铁转运蛋白运送到循环中，膜铁转运蛋白一种高度稳定的多跨膜蛋白，也是已知的哺乳动物中唯一参与铁输出的蛋白。通过膜铁转运蛋白转运输出的Fe2+在肠上皮细胞基底外层由膜结合的多铜氧化酶催化再氧化，之后再加载在运铁蛋白上(运铁蛋白是一种在血浆中循环并将铁输送到外周组织的蛋白质)，全转移蛋白(与两个铁原子结合)通过与大多数细胞表面表达的运铁蛋白受体结合，将铁传递给细胞，随后运铁蛋白受体1/运铁蛋白复合体发生内吞作用，将铁运入细胞内。在机体中，Fe3+经铁还原酶还原为Fe2+，并通过二价金属离子转运体1在内生膜中运输，输入的Fe2+参与铁代谢，瞬间转入铁池中。细胞内铁池可以进行如下几种功能：①与铁依赖酶和蛋白质结合行使功能；②与血红素(线粒体膜转运后)和铁硫团簇结合发生反应；③储存铁蛋白。多余的铁由铁泵蛋白辅助输出。通过这些过程吸收的铁在巨噬细胞中被有效回收，巨噬细胞吞噬衰老的红细胞，从血红蛋白中提取铁，并通过铁泵蛋白介导的外排将铁运送回循环。系统肽激素铁调素与铁泵蛋白结合，促进其磷酸化使溶酶体降解，对网状内皮系统的肠铁吸收和铁循环均有负调控作用。血清铁被认为是体内铁储备的一种较低特异性的标志物，而转铁蛋白饱和度已被证明能较好地反映组织铁储备[9]。直到研究者对铁调控蛋白(如转运蛋白、还原酶、氧化酶、调控蛋白和铁外排泵)的鉴定做出突破性进展后，人们才能够准确地理解铁在细胞和组织中的转运，为后续研究的展开铺垫了坚实的基石[10]。铁代谢的新调节剂，包括运铁蛋白、溶质载体家族39，也称为锌铁调控蛋白，包含14个成员，传统上被理解为包含跨膜锌转运蛋白，可将细胞外Zn2+泵入细胞内。研究发现了两种锌铁调控蛋白-在铁运输中起到至关重要的作用[11]。另外聚-结合蛋白在释放铁蛋白结合的铁过程中起到了接受货物受体的作用[12]。ROS是一种高度反应的分子，能够诱导脂质过氧化和DNA氧化损伤，从而促进肿瘤生长[13]，ROS在细胞死亡中的研究已相对透彻，而在肺癌铁死亡机制通路中的研究目前尚少。Yang等[14]研究发现，使用铁螯合剂或敲除核受体共激活剂4可以防止青蒿琥酯诱导的细胞凋亡，可能与青蒿琥酯和增加的溶酶体铁反应生成ROS有关，但具体上游下游及关键通路还不明确。

2 铁异常与肿瘤

早年研究者证实，铁代谢失调和过量的铁积累可增加癌症风险，促进肿瘤生长，已有多个实验及流行病学研究证实了这一点[15]。虽然铁在氧化还原反应中起着重要作用，并作为体内酶反应的辅助因子，但是铁在人体蓄积超负荷时，可通过产生ROS增加癌症风险[16-17]。在癌细胞中，研究者已经观察到控制编码调控铁蛋白的转录本的机制受到干扰，包括微RNA、甲基化和乙酰化的差异，这些新发型可能最终为治疗癌症提供新的方案选择。

有研究证明，低频磁场通过抑制细胞铁代谢、稳定p53蛋白、激活p53-miR-34a-E2F1/E2F3通路抑制肺癌发生发展[18]。也有研究表明，一些药物可以通过激活铁离子产生抗肿瘤作用，如柳氮磺吡啶和青蒿琥酯[19]。与正常细胞相比，癌细胞对铁的依赖性更强，表现为癌症患者体内铁大量流失，这种现象称为铁成瘾[20]。肿瘤患者体内铁失调常引发肿瘤患者的癌症相关性贫血。有研究发现，表皮生长因子受体通过铁蛋白的再分配调节铁的稳态，增加细胞铁的输入，促进肺癌的发展[21]。

铁具有催化氧化还原反应的能力，铁治疗可能与氧化应激有关，肺是唯一易受氧化应激影响的器官，关于铁治疗的相关研究也将受到研究者的关注。流行病学调查显示，低频磁场对机体生长及疾病发生有影响[18]。体外实验研究证实，低频磁场可以诱导细胞生长停滞、细胞衰老，抑制肺癌细胞铁代谢，Fonseca-Nunes等[16]研究小鼠肺癌模型发现低频磁场(0.4 T,7.5 Hz)，通过激活p53-miR-34a-E2F1/E2F3通路抑制铁代谢，进而抑制肺癌生长。可见铁元素的物理特性在肺癌乃至肿瘤的药物治疗、物理治疗均可能发挥巨大作用。Wang等[22]研究表明，氧化铁磁性纳米颗粒是一种具有生物相容性和低毒性的纳米材料，联合一种从黄连根茎中分离得到的三萜苷类化合物诱导细胞凋亡，以p53依赖的方式抑制非小细胞肺癌的生长。铁代谢失调引发肺癌的详细机制还有待进一步研究。

3 铁死亡

铁死亡是一种由有毒脂质过氧化集聚引起的非凋亡形式的细胞死亡方式，由Dixon等[23]在RAS(rat sarcoma)选择性小分子药物研究中提出，是一种具有铁离子依赖性、氧化型的细胞死亡方式。铁死亡无论在形态学、生物合成还是基因水平上与目前已知的细胞凋亡、副凋亡、胀亡、自噬、坏死、角化、焦亡及其他形式的细胞死亡均不同。细胞内ROS的积累是铁死亡的直接原因之一。

研究观察到高间充质细胞状态在人类癌细胞系和细胞质中的耐药特性，它依赖于一种可药物化的脂质过氧化物酶途径，这种途径可防止铁中毒[24]。Yang等[25]研究这种脂质代谢依赖于聚集在磷脂谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase,GPX)4上的通路，GPX4是一种含硒半胱氨酸的酶，能分解脂质过氧化物，阻止铁介导的过氧化物反应，导致铁死亡。铁死亡是一种铁依赖的细胞调节性死亡方式，而调节性细胞死亡在维持正常细胞的生长、内环境稳定以及快速增殖类疾病(如肿瘤)的发生发展中具有重要作用。具有代表性的调节性细胞死亡方式的比较，见表1。

有关铁死亡发生的机制，目前研究主要有三大类：铁稳态[37]、氧化应激[38-39]、谷氨酸异常所引起的兴奋性毒性[40]。三者相辅相成、相互作用，共同促进铁死亡的发生发展。铁死亡的形态学特征主要为扫描电镜下内质网的皱缩、内质网膜密度的增加，而线粒体氧化呼吸链传递受损所致的氧化还原损伤主要为线粒体肿胀[41]。铁死亡在代谢方面的改变主要包括：①细胞内还原型谷胱甘肽减少，导致细胞内还原解毒系统受损；②细胞内铁聚焦；③脂质过氧化细胞膜以及亚细胞器膜发生脂质过氧化[42]。现阶段铁死亡检测主要基于以上三点代谢改变，如细胞内谷胱甘肽检测、铁检测、丙二醛检测[43]。铁死亡在基因组学方面主要是以谷氨酸/胱氨酸转运系统以及下游的GPX4为中心的基因蛋白组学研究。研究表明，含铁血红素加氧酶-1在铁死亡通路中发挥了作用，缺氧诱导因子通过铁死亡相关基因(储铁效应元件结合蛋白2基因、ATP5G3、Cs及Rp18)影响铁死亡进程[44]。

4 铁死亡在肺癌方面的研究

铁死亡主要聚焦于肿瘤、神经系统等疾病的发生方面。Yagoda等[45]在K-ras突变的A549肺癌细胞中发现铁死亡。近年来文献报道，野生型和突变型的p53均可以在ROS累积的条件下，通过抑制细胞表面氨基酸运载蛋白的表达，阻止细胞摄取胱氨酸诱导细胞铁死亡[46]。Vu和Vassilev[47]研究发现，半胱氨酸脱硫酶是一种铁硫团簇生物合成酶，它从半胱氨酸中摄取硫并用于生物合成铁硫族，是氧化损伤敏感的蛋白质辅因子，存在于48种人类酶中，并通过维持铁硫辅因子，在高氧张力下保护细胞不发生铁死亡。半胱氨酸脱硫酶和细胞色素转运的协同抑制可在体外诱导铁离子增多，抑制肿瘤生长。高氧浓度可加速铁硫族的降解，而充足的铁硫族是保证肿瘤细胞行使基本功能的重要基础。研究发现，肺癌中可以检出半胱氨酸脱硫酶，位于肺腺癌中存在的基因组扩增区域，在分化良好的腺癌中表达最高。这种酶对肺癌细胞的生长必不可少，它的检出进一步说明了铁硫族在肺癌细胞中需求量大，一旦铁硫族匮乏就会通过刺激铁饥饿反应激活肺癌细胞铁死亡敏感通路[48]。铁死亡诱导原件和铁死亡在肺癌的发生发展中起着不可或缺的作用。

表1 具有代表性的调节性细胞死亡方式的比较

Matsushita等[46]通过高通量筛选发现第一个铁死亡诱导复合物Erastin和ras选择性致死化物3。Erastin是一种铁死亡诱导剂，可以抑制胱氨酸的导入，并降低谷胱甘肽水平，从而诱导铁死亡。Erastin在肺癌、胃癌、肝癌、乳腺癌、结肠癌、白血病等中诱导铁死亡均有报道[49]。胞外信号调节激酶(extracellular signal-regulated kinase，ERK)通路的激活被认为是铁死亡的标志之一，ERK水平与铁死亡进程呈正相关[50]。铁螯合剂主要阻断铁死亡发生，目前已用于临床治疗，包括亲脂性铁螯合剂(氧合酶、氧化性多不饱和脂肪酸、去铁胺)。体内、体外及临床前研究证明，铁螯合剂可抑制肿瘤的生长，为肿瘤的治疗进一步提供了选择方案；但临床数据显示，许多肿瘤铁螯合剂对肿瘤无效，包括肺癌[51]，可能与铁螯合剂在实体肿瘤中的药动学相关，也可能与晚期肺癌细胞低氧浓度有关。所以，不能排除铁螯合剂对早期肺癌细胞有效的可能，这也为研究早期肺癌治疗提供了新思路。目前关于铁死亡诱导剂的实验室和临床研究均逐步增多，诱导铁死亡的临床研究药物见表2，诱导铁死亡的实验研究药物见表3。

铁死亡是一种程序性坏死，其免疫原性较凋亡强。由于与分子模式释放相关的损伤，铁死亡过程被认为是一种促炎过程，但是研究者们认为铁死亡与坏死性炎症之间并没有直接关联。铁死亡通过传递趋化信号，在肿瘤部位具有招募和激活免疫细胞的能力，为铁死亡诱导剂作为检查点抑制剂等抗肿瘤免疫治疗增强剂提供了可能。事实上，当小鼠肿瘤异种移植体在超细纳米颗粒诱导下发生铁死亡时，肿瘤内可观察到大量免疫细胞。虽然目前对铁死亡诱导物所发挥作用的机制了解尚少，但铁死亡可能为逆转耐药性和增强宿主免疫系统提供一种新的抗癌治疗方案。尽管铁死亡在癌症治疗中被寄予了很高的希望，但在临床前期研究和临床应用中仍有大量问题亟须解决，如在不同研究背景下观察p53或ras突变的癌细胞存在的复杂性；另外，GPX4作为铁死亡抑制剂会影响神经系统和肾脏的发育功能，这些均增加了研究和实现临床应用的难度。

表2 诱导铁死亡的临床研究药物

表3 诱导铁死亡的实验性研究药物

研究发现，顺铂是A549和HCT116细胞中铁死亡及细胞凋亡的诱导剂，其机制可能与顺铂引起的还原型谷胱甘肽的消耗和GPX4的失活有关[57]。此外，顺铂和Eaststin的联合治疗对抗肿瘤活性显示出明显的协同作用，可能与谷胱甘肽下调以及GPX失活刺激Erastin通路有关，最终导致肺癌细胞通过铁离子减少对顺铂产生敏感性，为包括肺癌在内的许多肿瘤化疗药提供了抗癌新思路。Gai等[62]研究出对乙酰氨基酚通过对非小细胞肺癌NRF2-血红素加氧酶-1信号通路的调控，进一步增加Erastin的敏感性进而诱导铁死亡。根据ONCOMINE数据库、临床标本和细胞操作的结果显示，GPX4在非小细胞肺癌组织和细胞系中表达上调,GPX4在大多数肿瘤组织中表达水平高于正常组织；GPX4在肺腺癌中表达水平高于肺鳞癌，而高表达的GPX4预测肺癌预后极差。Lai等[63]研究发现，丝氨酸苏氨酸酪氨酸激酶1与GPX4在非小细胞肺癌中均高表达，过表达的丝氨酸苏氨酸酪氨酸激酶1可以抑制铁死亡，通过敲低GPX4可以逆转这种抑制作用。具体作用通路还有待研究者深入挖掘。周期蛋白依赖性激酶是细胞周期转变的驱动因子。Kuang等[64]研究表明，周期蛋白依赖性激酶1抑制剂和铁缺乏是针对信号通路糖蛋白130/信号转导及转录激活因子3靶点的潜在治疗肺癌策略。目前已有研究显示，铁死亡在胰导管腺癌、肝癌、神经母细胞瘤、横纹肌肉瘤、胶质瘤等肿瘤发生发展的通路机制。而更多关于铁死亡在肺癌的机制通路及治疗方案尚待进一步探索。

目前有关血清铁水平与肺癌风险的评估性研究较多，虽然减少铁在肺癌患者体内的贮存有利于抑癌，但这并不一定意味着血清铁水平的升高就一定会促进肺癌的生长。有荟萃分析表明，血清铁水平与肺癌风险无显著相关性[51]。而Ward等[65]的一项前瞻性研究显示，较高血清铁的摄入与肺癌风险有一定关系。因此，相关研究有待持续跟进。

5 小 结

铁死亡在抗肿瘤治疗中有很大潜力，为一些药物的临床效用研究提供了新途径，起到老药新用、新药再用的效果。但是仍有很多问题尚待研究，如铁死亡激发机体免疫原性引发机体适应性的具体发生分子机制目前仍不清楚；在铁死亡发生机制中，具体哪些脂类物质被氧化，以及在分子水平是通过何种方式与其他细胞死亡形式相互作用等问题亟待解决。对铁死亡的深入研究有助于更充分认识相关疾病的发生进展机制。铁死亡抑制剂在一定程度上能够延缓疾病进程，减轻患者病情，这可能作为今后基础机制研究和临床应用的切入点，在肿瘤的治疗和预防中发挥作用。随着肺癌检出率的提高，在原有的手术、化疗、放疗、分子靶向、免疫治疗等治疗基础上，更多新的有效治疗不断被挖掘。