芦丁对高脂饲养阿尔茨海默病模型SAMP8小鼠认知功能的影响

梁 锐， 周欢欢，万忠晓，吕全军

1)郑州大学第一附属医院营养科 郑州 450052 2)苏州大学公共卫生学院营养与食品卫生学系 江苏苏州 215123

阿尔茨海默病(Alzheimer′s disease，AD)是常见的神经退行性疾病，临床表现为渐进性记忆丧失、认知能力下降并伴有焦虑等其他精神相关症状。目前临床上尚缺乏有效的治愈方法或药物。芦丁是黄酮类化合物代表之一，已有文献[1-3]证明它具有抗氧化、抗炎症、抗过敏、抗病毒等作用。有研究[4]报道芦丁可缓解脑损伤,改善衰老小鼠的认知功能。但目前对于芦丁防治AD的作用机制方面研究较少。本研究以SAMP8小鼠[5]为AD模型动物，探讨芦丁对AD小鼠学习记忆功能的影响及其作用机制，为AD的防治提供新的思路。

1 材料与方法

1.1实验动物、主要药品与试剂及主要仪器设备24只10周龄雄性SAMP8小鼠购自北京大学医学部实验动物中心。芦丁(纯度≥98%)购自美国Sigma公司，SDS-PAGE购自江苏碧云天生物技术研究所，硝酸纤维素膜购自美国Bio-Rad公司，ECL化学发光试剂盒购自美国Amersham公司，β-淀粉样相关蛋白[解整合素金属蛋白酶10(disintegrin metalloproteinase10，ADAM10)(cat#sc-48400)单克隆抗体购自美国Biolegend公司，胰岛素降解酶(insulin degrading enzyme，IDE) (cat#ab32216)和组织蛋白酶B(cathepsin B, CTSB) (cat#ab58802) 单克隆抗体购自英国Abcam公司，淀粉样前体蛋白(amyloid precursor protein, APP) (cat#2450)和β-分泌酶1(β-secretase1，BACE1)(cat#5606)单克隆抗体购自美国Cell Signaling公司，β-淀粉样蛋白42(amyloid β-protein 42,Aβ42)(cat#805501)单克隆抗体购自美国Biolegend公司]，神经炎症相关蛋白[鼠胶质纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein, GFAP) (cat#3670)单克隆抗体购自美国Cell Signaling公司，小胶质细胞/巨噬细胞特异性蛋白抗体1(ionized calcium binding adapter molecule1, Ibα1) (cat#016-20001)单克隆抗体购自美国Santa Cruz公司]，β-肌动蛋白(β-Actin)(cat#4970) 单克隆抗体购自美国Cell Signaling公司，驴抗兔IgG 和羊抗鼠IgG购自美国Jackson 免疫研究实验室；其他试剂均为分析纯。Morris水迷宫系统和Supermaze行为学实验分析系统购自上海欣软信息技术有限公司，全自动样品快速研磨仪购自上海净信科技有限公司，垂直电泳槽和中型Trans-Blot转印槽购自美国Bio-Rad公司，化学发光成像仪购自英国Syngene公司。

1.2动物分组及干预实验遵循实验动物使用准则并通过苏州大学动物伦理委员会许可。24只小鼠适应性饲养1周后，随机分为3组(每组8只)：低脂饮食组(LFD组)、高脂饮食组(HFD组)和高脂饮食添加芦丁组(HR组)。LFD组饲料供能比：脂肪10%、碳水化合物70%及蛋白质20%；HFD组饲料供能比：脂肪60%、碳水化合物20%及蛋白质20%。HR组给予添加有质量分数0.1%芦丁的高脂饲料(即100 mg芦丁添加到100 g HFD饲料中)。所有饲料均购自江苏美迪森生物医药公司。总干预周期为18周。实验期间，每周称量小鼠体重和摄食量。

1.3各组小鼠学习和记忆能力的检测[6]实验历时4 d，每天分上、下午各训练4次。每次训练时将小鼠面向池壁从4个入水点放入水池(同一次训练的小鼠采用相同的入水点)。训练开始后，系统自动记录小鼠入水后找到平台并站立于其上所需的时间，即逃避潜伏期。在规定时间(90 s)内找不到平台的小鼠，将其引导到平台，相应的潜伏期记为90 s。每次小鼠爬上或被引导到平台，在平台上学习20 s。训练间隔时间1 h。取每天4次潜伏期的算术平均值做为当天的平均逃避潜伏期。训练结束当天(第4天)下午撤下平台，选择一个象限作为入水点，将小鼠面向池壁放入水中，记录小鼠在90 s内穿越平台的次数(记忆潜伏期)及在原平台所在象限及其他3个象限内停留的时间，用于反映小鼠对水迷宫学习和记忆能力。

1.4各组小鼠海马区Aβ相关蛋白、神经炎症相关蛋白表达的Western blot法检测完成1.3项的实验后处死小鼠，取海马组织，提取蛋白，进行蛋白电泳后转膜转至硝酸纤维素膜，50 g/L脱脂牛奶液封闭1 h。洗膜3次后，加入相应的一抗(β-actin 抗体按1∶5 000稀释，Nrf2 抗体按1∶1 000稀释，其余均按1∶100稀释)，4 ℃孵育过夜。洗膜3次后，加入二抗(按1∶2 000稀释)，室温继续孵育1 h。最后加入化学发光HRP底物，于化学发光成像仪进行分析。以β-actin为内参。用Image J软件扫描，以目的条带与β-actin条带灰度值的比值表示目的蛋白表达水平。

1.5统计学处理采用SPSS 19.0进行数据分析。应用重复测量数据的方差分析比较3组小鼠水迷宫实验中逃避潜伏期的差异，应用单因素方差分析和LSD-t检验比较3组小鼠在原平台所在象限停留时间、穿越平台次数、海马区Aβ以及神经炎症相关蛋白含量的差异，检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 3组小鼠水迷宫实验结果见表1、2。在逃避潜伏期的检测过程中发现，在第3天和第4天时，HR组和HFD组的逃避潜伏期短于LFD组。3组的逃避潜伏期时间最终均有减少，且HFD组的效果略优于LFD组。去除原平台后，各组小鼠在原平台所在象限停留时间差异无统计学意义(P>0.05), 但是HR组小鼠穿越平台次数多于另外2组(P<0.05)。

表1 3组小鼠平均逃避潜伏期的比较(n=8) s

表2 3组小鼠在原平台所在象限停留时间和穿越次数的比较

2.2 3组小鼠海马区Aβ相关蛋白表达的检测结果见表3。由表3可知，与LFD组和HFD组相比，HR组小鼠IDE蛋白表达水平增加(P<0.05)；而Aβ42 蛋白表达水平减少(P<0.05)。与LFD组和HR组相比，HFD组ADAM10蛋白表达水平减少、APP蛋白表达水平增多(P<0.05)。3组β-分泌酶1和组织蛋白酶B蛋白表达水平差异无统计学意义(P>0.05)。

表3 3组小鼠海马区Aβ相关蛋白表达水平的比较

2.3 3组小鼠海马区神经炎症相关蛋白表达的检测结果见表4。由表4可知HR组海马区神经炎症相关蛋白的GFAP和Ibα1表达水平低于LFD组。

表4 3组小鼠海马区神经炎症相关蛋白表达水平的比较

3 讨论

AD的病因及分子机制十分复杂，最典型的病理变化为Aβ沉积形成老年斑和细胞内过度磷酸化Tau蛋白形成的神经元纤维缠结[7]。因此，我们认为降低Aβ水平以及减少Tau蛋白过度磷酸化是预防和延缓AD的重要靶点。

本实验中，小鼠被干预后，水迷宫实验结果显示HR组小鼠逃避潜伏期以及穿越平台所在象限的次数均减少，提示芦丁干预具有较好的改善AD模型小鼠学习记忆能力的作用。

脑中Aβ水平，第一取决于APP产生Aβ的量，第二取决于Aβ的降解和清除。APP是一种跨膜蛋白，在体内各组织广泛存在。其有两种经典代谢途径：一种是产生Aβ的代谢途径，经β-分泌酶和γ-分泌酶作用产生Aβ。Aβ主要包括含40个氨基酸的Aβ40和含42个氨基酸的Aβ42，后者比前者更易于积聚，具有更强的神经细胞毒性[8]。另一种是不产生Aβ的代谢途径，这一途径由α-分泌酶和γ-分泌酶分解产生APP的神经细胞膜内片段(APP intracellular domain，AICD),无Aβ产生[9]。并已证实，两条代谢途径存在相互竞争关系，即α-分泌酶和β-分泌酶竞争同一作用底物APP[10]。ADAM10已被确认具有α-分泌酶活性，可发挥α-分泌酶的作用，对减少Aβ的产生具有重要作用[11]。β-分泌酶的全称为β位点APP水解酶(β-site APP-cleaving enzyme，BACE)，其有两种亚型，BACE1和BACE2。BACE1广泛表达于脑组织中，在APP降解生成Aβ的过程中发挥了重要的作用。当BACE1减少或者失活时，Aβ沉积会显著减少[12]。从本实验结果中可以看到，高脂饮食会导致小鼠海马区ADAM10蛋白含量减少和APP蛋白含量增加，从而促进Aβ的产生和沉积增多；但在高脂饮食基础上加了芦丁干预后，小鼠海马区的Aβ42蛋白含量减少，差异有统计学意义；这提示芦丁能减少Aβ的产生和沉积，对AD具有改善作用。

IDE基因是存在于10号染色体上的Aβ调控基因，它是体内能降解Aβ的主要蛋白酶之一[13]。体外实验[14]发现，IDE可以使Aβ介导的神经毒作用降低，同时清除细胞内的APP。过度表达的IDE可以减少Aβ水平，甚至延缓或完全阻止Aβ沉积，因此，其对Aβ的降解具有关键作用[15]。蛋白酶在病理状态下可被释放，介导细胞炎性坏死以及凋亡。其在肿瘤的浸润于转移、AD、多发性硬化症等疾病中有着重要作用[16]。CTSB是蛋白酶家族的一个重要成员，其与Aβ的清除有关，可帮助AD模型鼠清除脑内老年斑[17]。从本实验结果可知，HR组的小鼠海马区的IDE蛋白含量与其他两组相比升高，差异有统计学意义；而3组小鼠海马区的CTSB蛋白含量差异无统计学意义，这提示高脂饮食结合芦丁干预对Aβ的降解可能主要通过IDE介导，而与CTSB没有明显联系。

脑内应对组织损伤产生的炎症反应是中枢神经系统一种基本的保护性免疫反应，有助于组织再生与修复。但是，长期持续的炎症反应会导致一些疾病的发生，比如AD。AD患者脑内由小胶质细胞和星形胶质细胞活化发生的炎症反应可能是导致其神经病理学变化的一个重要因素[18]。GFAP是星形胶质细胞活化的标志物，Iba1是小胶质细胞特异性的钙结合蛋白，此两者均可分别作为细胞的标记物。本实验结果显示HR组GFAP和 Iba1均低于其他两组，这提示高脂饮食结合芦丁干预对减少GFAP和 Iba1，改善AD具有重要意义。

综上所述，芦丁可减少Aβ的产生和沉积，降低Aβ水平，并改善神经炎症反应，具有较好的改善AD模型小鼠学习记忆能力。这为探索芦丁在AD的防治研究提供了实验依据。