食管鳞状细胞癌组织中MRDI的表达及下调MRDI表达对食管癌细胞侵袭能力的影响

秦 宁，刘宗文，张 艳，杨 瑜，刘耀河，侯 歌，宋 锐，袁金金

1)郑州大学第二附属医院放射治疗科 郑州 450014 2)郑州大学基础医学院药理学教研室 郑州 450001

食管癌是指原发于食管上皮的恶性肿瘤。据2018年世界卫生组织发布的《世界癌症报告》统计，全球食管癌新发病例数约为57.2万，在36种癌症中占3.2%，排第7位；死亡例数约50.8万，在36种癌症中占5.3%，排第6位[1]。在我国，食管癌也是最常见的消化道恶性肿瘤之一，其发病率及死亡率分别占我国恶性肿瘤的第5位和第4位[2]。食管癌在消化系统恶性肿瘤中具有发病率高，诊断率低，且预后不佳的特点。食管癌按组织学分类可分为鳞状细胞癌(简称鳞癌)和腺癌，亚洲主要的组织学类型是食管鳞癌[3]，在我国，鳞癌的占比达90%。

近年研究[4-5]表明Ras同源基因家族成员A(Ras homolog gene family member A，RhoA)是Ras超家族中的一种小G蛋白分子，具有GTP酶活性；RhoA对肿瘤的侵袭和转移有促进作用。随着对Rho家族研究的逐步深入，一种名为“依赖RhoA的侵袭媒介”(mediator of RhoA-dependent invasion，MRDI)的基因被发现，它具有促进细胞侵袭和细胞运动的特征，有代谢酶和细胞侵袭媒介两种作用。有研究[6-7]显示，MRDI与转移性黑色素瘤、卵巢癌、乳腺癌、前列腺癌等肿瘤的转移侵袭性相关。本实验采用免疫组化SP法检测食管鳞癌组织及癌旁组织中MRDI蛋白的表达，探讨MRDI蛋白的表达与食管癌患者临床病理参数及术后生存的关系,以及下调MRDI蛋白表达后食管鳞癌细胞株侵袭能力的变化。

1 对象与方法

1.1研究对象郑州大学第二附属医院2014年4月至2015年10月收治的45例食管鳞癌患者的手术切除标本(含癌和癌旁组织)，均经病理确诊。45例中男31例，女14例，年龄45～78岁；低分化15例，高中分化30例；Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ期分别有5、15、21、4例; 有淋巴结转移25例。入组条件：术前均未接受过放、化疗以及其他特殊治疗。EC109和EC9706细胞由郑州大学第一附属医院病理科捐赠。

1.2免疫组化染色检测MRDI蛋白的表达将收集到的食管鳞癌及癌旁组织病理切片经烤片、脱蜡、水化、抗原修复、阻断内源性过氧化物酶、山羊血清工作液封闭等步骤后，加MRDI抗体(Gebtex公司，按1∶200稀释)，4 ℃孵育过夜，加入适量生物素标记的山羊抗小鼠IgG和辣根过氧化物酶标记的链霉卵白素工作液，经DAB显色、苏木精复染、脱水、透明等步骤，中性树脂封片进行观察。400倍显微镜下选取5个视野，每个视野计数100个细胞。用PBS代替一抗为阴性对照。细胞中出现细小的棕黄色颗粒为阳性。染色结果评分标准[8]：阳性细胞百分比<5%计0分，5%～计1分，26%～50%计2分，>50%计3分；阳性细胞染色淡黄色计1分，深黄色计2分，棕褐色计3分。两项得分乘积>3分为高表达，≤3分为低表达。由病理科的两名专业人员使用双盲法阅片并评分。

1.3入组患者随访对45例食管鳞癌患者进行随访(电话随访及查阅本院相关就诊记录)，了解患者确诊食管癌后的治疗、生存及肿瘤侵袭转移情况，进行Kaplan-Meier生存分析。

1.4下调MRDI的表达对食管鳞癌细胞侵袭能力的影响

1.4.1 细胞转染 实验前EC9706和EC109均转染含绿色荧光蛋白的siFAM NCtrl，荧光显微镜下显示两种细胞株生长状态良好，且转染效率均在80%以上。将处于对数生长期的EC109和EC9706细胞按照3.5×105个/孔接种于6孔板中培养过夜，分为5组：空白对照组、siNCtrl组(阴性对照组)、MRDI-siRNA#1组、MRDI-siRNA#2组、MRDI-siRNA#3组。待细胞生长到50%～60%融合时，用上述siRNA和锐博转染试剂转染细胞，并用无双抗培养基培养过夜。

1.4.2 qRT-PCR法检测细胞中MRDI mRNA的表达 取分组处理后且细胞融合度达80%～90%的EC109和EC9706细胞，加入Trizol提取总RNA，反转录为cDNA。以cDNA为模板，上机进行扩增。引物序列(表1)由生工生物工程(上海)股份有限公司设计及合成。50 μL PCR体系：1.5 μL cDNA，5 μL 10×PCR buffer，3 μL 20 mmol/L MgCl2，1 μL 10 mmol/L dNTPs，1 μmol/L的上下游引物 各1 μL，0.8 μL Taq酶，36.7 μL DEPC水。反应条件：50 ℃ 2 min；95 ℃ 10 min；95 ℃ 15 s，35～40个循环；58 ℃ 1 min。用2-ΔΔCt法计算MRDI mRNA的相对表达量。

表1 MRDI及β-actin引物

1.4.3 Western blot法检测细胞中MRDI蛋白的表达 取分组处理后且细胞融合度达80%～90%的EC109和EC9706细胞，加入预冷的细胞裂解液冰上裂解30 min，在EP管中超声裂解2 min，离心后采用BCA蛋白定量试剂盒检测蛋白浓度，加入上样缓冲液后煮沸备用。根据凝胶制备试剂盒说明书制备分离胶与浓缩胶，上样后进行电泳，恒压80 V 120 min后转至恒压120 V，溴酚蓝临近胶底部停止电泳。后续经转膜、封闭、4 ℃一抗(MRDI按1∶1 000稀释)孵育、二抗孵育，用ECL发光剂进行显影。用Image J软件分析，以目的蛋白条带和内参β-tubulin条带灰度值的比值作为目的蛋白的相对表达量。

1.4.4 Transwell法检测细胞的侵袭能力 取处于对数生长期的EC109和EC9706细胞，分别转染siNCtrl和转染效果最佳的MRDI-siRNA#2。用不含血清的RPMI 1640培养基稀释Matrigel胶，上室铺胶后将细胞接种至上室中，在对应的下室加上含体积分数5%胎牛血清的RPMI 1640培养基。培养过夜，用棉签抹去上室中未穿膜的细胞，甲醇固定，结晶紫染色之后，倒置显微镜(×400)下观察并拍照。

1.5统计学处理采用SPSS 21.0处理数据。应用配对χ2检验比较食管鳞癌及癌旁组织中MRDI蛋白表达的差异，应用χ2检验或者校正χ2检验分析MRDI蛋白表达与食管鳞癌患者临床病理参数的关系，生存曲线由Kaplan-Meier法绘制。检验水准α=0.05。

2 结果

2.1食管鳞癌及癌旁组织中MRDI蛋白的表达情况与癌旁组织[33.3%(15/45)]相比，食管鳞癌组织中MRDI蛋白的高表达率[66.7%(30/45)]增加(P<0.05)，见表2，图1A、1B。MRDI蛋白主要表达于癌细胞的胞质，细胞核亦有少量表达(图1B)；癌旁组织中MRDI蛋白主要定位于细胞核(图1C)；部分癌旁组织中MRDI蛋白的分布具有积聚现象，主要富集于细胞质膜的前缘(图1D)。

表2 食管鳞癌及癌旁正常组织中MRDI蛋白的表达 例

A、C、D：癌旁组织；B：癌组织

2.2食管鳞癌组织中MRDI蛋白的表达与食管鳞癌患者临床病理参数的关系MRDI蛋白在低分化、病理分期T3+T4期及脉管癌栓阳性的食管鳞癌患者中的表达升高(表3)。

表3 食管鳞癌组织中MRDI蛋白的表达与患者临床病理参数的关系 例

续表3

2.3MRDI蛋白表达与食管鳞癌患者术后生存的关系生存曲线(图2)表明，与MRDI蛋白低表达者相比，MRDI蛋白高表达者预后差(χ2=5.058，P=0.025)。

图2 MRDI蛋白表达与食管鳞癌患者术后生存的关系

2.4下调MRDI后EC9706和EC109细胞侵袭能力的变化qRT-PCR和Western blot结果显示，MRDI-siRNA#2转染效果最佳(图3、4)。与siNCtrl组相比，转染MRDI-siRNA#2后，EC109及EC9706侵袭细胞数均减少(图5)。

1～5：分别为空白对照组、siNCtrl组、MRDI-siRNA#1组、MRDI-siRNA#2组、MRDI-siRNA#3组

EC109：1～5分别为空白对照组、MRDI-siRNA#1组、MRDI-siRNA#2组、MRDI-siRNA#3组、siNCtrl组；EC9706：1～5分别为空白对照组、siNCtrl组、MRDI-siRNA#1组、MRDI-siRNA#2组、MRDI-siRNA#3组

A、B：转染siNCtrl、MRDI-siRNA#2的EC109细胞；C、D：转染siNCtrl、MRDI-siRNA#2的EC9706细胞

3 讨论

Meta分析[9]显示79 777名食管癌患者的3 a生存率为46.0%，不同分期、组织学类型和肿瘤部位的食管癌患者之间存在差异。食管鳞癌具有晚期诊断、死亡率高的特点，尽管过去几十年在外科和非手术治疗方面取得了进展，但由于缺乏合适的早期诊断和有效治疗的生物标志物，食管鳞癌的预后仍然很差。

RhoA是哺乳动物Rho GTP酶典型成员之一，其在活性状态与非活性状态之间相互转换，发挥一种类似“分子开关”的作用[10-11]。其活性形式与下游效应蛋白相互反应可激活细胞分裂、存活、迁移和黏附等多种生物进程[12]，基于这种作用，RhoA的异常活化(如过表达、异常突变)可激发肿瘤细胞无限增殖、浸润和转移机能。而MRDI基因作为一个依赖RhoA的基因，具有代谢酶和细胞侵袭媒介的双重作用。

本研究结果表明，MRDI在食管鳞癌组织中高表达，且在低分化、肿瘤浸润程度深、脉管癌栓阳性的食管鳞癌患者中表达高；MRDI高表达者预后差。另外，免疫组化结果显示，食管鳞癌癌旁组织中MRDI主要定位在胞核，少量位于胞质，而在食管鳞癌组织中主要在胞质，与Kabuyama等[13]在黑色素瘤中的研究结果一致。即在疾病晚期，MRDI蛋白在胞质中表达增加，胞核中表达减少；同时，作者还发现在部分癌旁组织中MRDI蛋白的分布具有积聚现象，主要富集于细胞质膜的前缘，考虑可能是非癌组织向癌组织转化的中间态，提示MRDI蛋白表达的变化较细胞形态学改变早。因此MRDI基因可能作为一个癌前基因来预测食管鳞癌的转移与进展，且MRDI蛋白的膜定位提示其可能参与细胞运动，对细胞侵袭、迁移有潜在的控制作用。作者利用siRNA下调食管癌EC9706和EC109细胞中MRDI的表达后，发现细胞的侵袭能力受抑，提示MRDI可能参与启动细胞运动相关基因，促进肿瘤细胞的侵袭、转移，然而具体机制还需要进一步的实验探究。

可以展望，MRDI作为一个新的基因靶点，可能为抗肿瘤新药的研发和食管癌的治疗提供新的思路。