龙蒿精油纳米胶囊制备工艺优化及结构表征研究

梁 英 张慧芸 康怀彬

(河南科技大学食品与生物工程学院，河南 洛阳 471003)

龙蒿(ArtemisiadracunculusL.)，属菊科蒿属多年生草本植物，是一种重要的药用和芳香植物[1-2]。龙蒿精油是通过蒸馏方法从龙蒿的花、茎、叶中提取得来，成分复杂，主要由甲基丁香酚、草蒿脑、α-蒎烯、β-蒎烯、罗勒烯、芳樟醇、柠檬烯等组成[3-5]。龙蒿精油具有助消化、利尿、开胃、催吐、驱虫、止泻、抗氧化、调节免疫系统、控制血糖、止痛、抗炎和抗癌等功效[6-8]，在医药、护肤和食品等领域中备受关注。但由于具有特殊性气味、挥发性较强、难溶于水且易受温度影响应用受限。

纳米胶囊化技术能保持活性分子的生物活性及稳定性，通过扩散过程来控制活性分子向纳米胶囊周围的释放[9-10]。目前，离子凝胶法、喷雾干燥法、层层自组装法和复合凝聚法等广泛应用于纳米胶囊的制备。其中，离子凝胶法具有成本低、操作简便、无有机溶剂的优点且制备的纳米胶囊具有良好的稳定性，因此被广泛应用于食品、药品、护肤品等领域[11]。在纳米胶囊制备中，为保证所制备产品具有安全性高、无毒、无污染等特性，倾向于选择天然高分子材料为壁材。壳聚糖(Chitosan，CS)是从甲壳类动物壳中经过脱矿质、脱蛋白和脱乙酰化形成的[12]，具有生物相容性、抗菌性和抗氧化活性，并且是活性化合物持续释放和传递的良好载体，是一种低成本材料，抑菌、无毒、安全性高的天然高分子聚合物[13]。Hasani等[14]以壳聚糖和改性淀粉为壁材，采用冷冻干燥法制备柠檬精油纳米胶囊，粒径范围为553.3～3 393.0 nm，通过差示扫描量热分析得出该纳米胶囊具有良好的物理化学性能和热稳定性。Sotelo-Boyas等[15]以壳聚糖为壁材，分别采用纳米沉淀法和纳米胶囊法制备柠檬精油纳米粒和柠檬精油纳米胶囊，在透射电子显微镜下发现纳米胶囊的平均粒径高于纳米粒。近年来，关于以植物精油为芯材制备微胶囊的研究越来越多，如丁香精油、肉桂精油和柠檬精油等，然而对龙蒿精油纳米胶囊的研究却未见报道。

研究拟以龙蒿精油为芯材，以CS为壁材，采用离子凝胶法制备龙蒿精油纳米胶囊，研究制备条件对纳米胶囊包埋率的影响，采用响应面法优化纳米胶囊制备工艺，同时对所制备纳米胶囊进行表征分析，为龙蒿精油纳米胶囊的制备及应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

龙蒿精油：食品级，江西环球天然香料有限公司；

壳聚糖：脱乙酰化≥95.0%，北京酷尔化学科技有限公司；

吐温-80：分析纯，天津市亚泰联合化工有限公司；

三聚磷酸钠：分析纯，山东唐正生物科技有限公司；

溴化钾：光谱纯，天津市光复精细化工研究所。

1.2 仪器与设备

傅里叶变换中远红外光谱仪：VERTEX70型，德国Bruker公司；

高分辨透射电镜：JEM-2100型，日本电子公司；

差示扫描量热仪：DSC3型，瑞士Mettler-Toledo公司；

紫外可见光分光光度计：UV-2600型，日本岛津公司；

台式高速冷冻离心机：H1850R型，湖南湘仪离心机仪器有限公司；

真空冷冻干燥机：LGJ-10D型，北京四环科学仪器厂有限公司。

1.3 方法

1.3.1 龙蒿精油纳米胶囊的制备 参照文献[16]的方法，并进行优化制备龙蒿精油纳米胶囊。将0.1 g CS溶解于50 mL乙酸溶液(体积分数1%)中，在60 ℃条件下磁力搅拌60 min后，形成CS溶液，并采用0.45 μm滤膜对其进行真空抽滤。加入约0.12 g的吐温-80作为精油乳化剂，并在60 ℃下磁力搅拌10 min，以形成均匀的溶液。将200 mg精油滴入CS/吐温-80溶液中，并在500 r/min 下搅拌60 min。将0.04 g三聚磷酸钠(Sodium Tripolyphosphate，TPP)溶解于10 mL蒸馏水中制备TPP溶液，随后，于500 r/min磁力搅拌下，将TPP溶液缓慢地加入到油载CS/吐温-80溶液中，搅拌60 min后得到均匀的龙蒿精油纳米胶囊分散液，添加0.5 mol/L HCl溶液调节其pH 3.5。最后将该分散液在4 ℃，10 000 r/min 条件下离心30 min，去除上清液，将得到的龙蒿精油纳米胶囊悬浮于蒸馏水中，在1 Pa条件下冻干24 h，于4 ℃保存。

1.3.2 单因素试验

(1) CS溶液pH对龙蒿精油纳米胶囊包埋率的影响：采用1.3.1的制备方法，TPP与CS质量比为0.4∶1.0，龙蒿精油与CS质量比为1.4∶1.0，将CS溶液pH调节为2.5，3.0，3.5，4.0，4.5。

(2) TPP与CS质量比对龙蒿精油纳米胶囊包埋率的影响：采用1.3.1的制备方法，CS溶液的pH为3.5，龙蒿精油与CS质量比为1.4∶1.0，将TPP与CS质量比分别设置为0.1∶1.0，0.2∶1.0，0.3∶1.0，0.4∶1.0，0.5∶1.0。

(3) 龙蒿精油与CS质量比对龙蒿精油纳米胶囊包埋率的影响：采用1.3.1的制备方法，CS溶液的pH为3.5，TPP与CS质量比为0.4∶1.0，将龙蒿精油与CS质量比分别设置为1.4∶1.0，1.6∶1.0，1.8∶1.0，2.0∶1.0，2.2∶1.0。

1.3.3 响应面试验 根据Box-Behnken试验设计原理，选取pH值、芯壁比以及TPP与CS的质量比为目标变量，以龙蒿精油纳米胶囊包埋率为因变量。

1.3.4 龙蒿精油纳米胶囊包埋率的测定 参照文献[17]的方法，并进行优化。在4 ℃，10 000 r/min条件下，将龙蒿精油纳米胶囊分散液离心30 min，收集上清液并用分光光度法于201 nm处测定其吸光度，并制备不含龙蒿精油的纳米胶囊分散液作空白对照。计算未包埋的龙蒿精油量m2，再按式(1)计算包埋率。

(1)

式中：

EE——包埋率，%；

m1——龙蒿精油添加总量，g；

m2——纳米胶囊悬浮液中未包埋的龙蒿精油量，g。

1.3.5 纳米胶囊的高分辨透射电镜形态观察 取少量空白胶囊冻干粉和纳米胶囊冻干粉作为样品，加入乙醇超声30 min制成悬浮液，滴入磷钨酸(2%)染色3 min后，将铜网没入染色液中，静置30 min，滤纸吸去多余液体直至干燥，最后用高分辨透射电镜在120 kV条件下观察纳米胶囊形态[18]。

1.3.6 龙蒿精油纳米胶囊的傅里叶红外光谱分析 参照文献[19]的方法，稍加改进，使用纯溴化钾作为空白背景，将纯CS粉、龙蒿精油、空白胶囊冻干粉和龙蒿精油纳米胶囊冻干粉分别研磨后压制成透明薄片，放入变换中远红外光谱仪中，在分辨率4 cm-1，4 000～400 cm-1的光谱范围内进行扫描。

1.3.7 龙蒿精油纳米胶囊的差示扫描量热仪分析 以纯CS粉、龙蒿精油、空白胶囊冻干粉和龙蒿精油纳米胶囊冻干粉为样品，将样品质量控制在5～15 mg，升温速率为15 ℃/min，测定温度区间为30～450 ℃[20]。

1.4 数据处理

所得数据取3次平行试验的平均值，用Microsoft Excel 2010以及Design Expert 11对试验数据进行处理(显著性水平P<0.05)，用Origin 8.5作图。

2 结果与分析

2.1 单因素试验

2.1.2 三聚磷酸钠与壳聚糖质量比对龙蒿精油纳米胶囊包埋率的影响 由图2可知，纳米胶囊包埋率随TPP与CS质量比的增大呈先上升后平缓下降趋势。这是由于聚阳离子CS可以与聚阴离子TPP发生静电相互作用，从而产生纳米胶囊[21]。随着TPP与CS质量比的增大，磷酸基团数量偏多，促使纳米胶囊体系的形成，从而使纳米胶囊包埋率升高。随着TPP与CS质量比的不断增大，包埋率反而下降，可能是由于CS的量相对不足形成的纳米胶囊壁较薄，不能完全包裹龙蒿精油，或者过量的TPP聚集在一起形成团簇，从而导致包埋率有所下降[19-20,22]。

图1 壳聚糖溶液pH对龙蒿精油纳米胶囊包埋率的影响

图2 三聚磷酸钠与壳聚糖质量比对龙蒿精油纳米胶囊包埋率的影响

2.1.3 龙蒿精油与壳聚糖质量比对龙蒿精油纳米胶囊包埋率的影响 由图3可知，龙蒿精油纳米胶囊的包埋率随龙蒿精油与CS质量比的增加呈先上升后下降趋势。这是由于芯壁比增加，芯壁材间的接触面积增加，有利于包裹龙蒿精油。当芯壁比过高(>2∶1)时，包埋率反而下降。这可能是由于相对于一定量的CS，龙蒿精油的量偏多，吐温-80的量相对不足，导致吐温-80的乳化效果较差、纳米胶囊包裹不完全或者形成的纳米胶囊的囊壁过薄，容易破裂并释放出龙蒿精油，导致包埋率下降[20]。

图3 龙蒿精油与壳聚糖质量比对龙蒿精油纳米胶囊包埋率的影响

2.2 响应面试验

2.2.1 响应面法设计与结果分析 根据单因素试验结果，设计响应面试验因素水平表见表1，试验结果见表2。

表1 响应面试验设计因素及水平

2.2.2 回归方程的建立与显著性分析 采用Design Expert 11软件对表2中的数据进行分析处理，得到回归方差分析表，并进行多元线性拟合，得到龙蒿精油纳米胶囊包埋率与各因素编码值之间的多元二次回归模型：

Y=43.94-0.694 9A+0.11B+1.95C-1.77AB+2.33AC+0.394BC-1.48A2-5.67B2-3.05C2。

(2)

表3 回归方程的显著性检验及方差分析†

2.2.3 各因素交互作用的响应曲面和等高线图分析 由图4可知，等高线呈椭圆形，随着pH和芯壁比的增加，包埋率呈先增加后减少趋势且响应曲面倾斜度高，说明pH和芯壁比的交互作用显著，与表3中AB交互项的分析结果一致。由图5可知，等高线呈椭圆形，随着pH和TPP与CS的质量比的增加，包埋率呈先增加后减少趋势且响应曲面倾斜度较高，说明pH和TPP与CS的质量比的交互作用显著，与表3中AC交互项的分析结果一致。由图6 可知，等高线呈圆形，随着芯壁比和TPP与CS的质量比的增加，包埋率呈先增加后减少趋势且响应曲面倾斜度较高，说明芯壁比和TPP与CS的质量比的交互作用不显著，与表3中BC交互项的分析结果一致。因此，响应曲面法可以用来优化龙蒿精油纳米胶囊的制备工艺。

图4 交互项AB的等高线和响应曲面Figure 4 Contour lines and response surfaces of the interaction term AB

图5 交互项AC的等高线和响应曲面Figure 5 Contour lines and response surfaces of the interaction term AC

图6 交互项BC的等高线和响应曲面Figure 6 Contour lines and response surfaces of the interaction term BC

2.2.4 响应面试验模型的验证 通过Design Expert 11软件得出龙蒿精油纳米胶囊的最佳制备工艺为芯壁比2∶1、pH 3.5，TPP与CS的质量比0.4∶1.0，预测包埋率为44.25%。以预测条件进行验证实验，重复3次，得出龙蒿精油纳米胶囊的平均包埋率为43.67%，结果稳定可靠，由此可见通过响应面法优化龙蒿精油纳米胶囊制备工艺可行。

2.3 纳米胶囊的高分辨透射电镜形态观察

高分辨透射电镜在120 kV下放大105倍的龙蒿精油纳米胶囊如图7所示，纳米胶囊均呈较规则圆形，是比较理想的颗粒形态。龙蒿精油纳米胶囊的直径约为40 nm，空白纳米胶囊的直径约为29 nm。

图7 纳米胶囊透射电镜图Figure 7 Transmission electron microscopy of the nanocapsules

2.4 龙蒿精油纳米胶囊的傅里叶红外光谱分析

a. 精油胶囊 b. 空白胶囊 c. 龙蒿精油 d. 壳聚糖粉图8 傅里叶红外光谱检测结果Figure 8 Detection results of Fourier infrared spectrum

2.5 龙蒿精油纳米胶囊的差示扫描量热仪分析

由图9可知，龙蒿精油的挥发速度随温度的升高而加快，在181 ℃时出现的吸热峰是由龙蒿精油分解汽化引起的[20]。CS曲线中，在88 ℃出现的吸热峰是由于CS中的水蒸发，在317 ℃出现的放热峰是由于CS的分解。空白胶囊在246 ℃出现放热峰，可能是因为CS与TPP发生静电相互作用，从而出现了能量变化[26]。与空白胶囊相比，精油胶囊在367 ℃出现的吸热峰，可能是由于中间产物发生热解焦化现象，导致龙蒿精油纳米胶囊破裂释放出龙蒿精油，进而引起龙蒿精油的分解汽化；与龙蒿精油相比，精油胶囊的吸热峰由181 ℃提高到367 ℃，说明纳米胶囊包埋了龙蒿精油，且对龙蒿精油起到了一定的保护作用，提高了龙蒿精油的热稳定性。精油胶囊曲线中，没有龙蒿精油的特征峰，表明龙蒿精油与壳聚糖之间发生了相互作用，壳聚糖包埋龙蒿精油。Feyzioglu等[27]研究香薄荷精油纳米粒子的制备，通过差示扫描量热分析发现，香薄荷精油纳米粒子的图中没有香薄荷精油的特征性熔融峰和结晶峰，表明壳聚糖包埋了香薄荷精油，与研究结果相似。

图9 差示扫描量热仪分析图Figure 9 Analysis diagram of differential scanning calorimeter

3 结论

试验通过离子凝胶法制备龙蒿精油纳米胶囊，通过Box-Behnken试验设计和响应面分析优化纳米胶囊制备工艺，得到龙蒿精油纳米胶囊的最佳制备工艺条件为芯壁比2∶1、pH 3.5、TPP与CS的质量比0.4∶1.0，此条件下制备的龙蒿精油纳米胶囊的包埋率为43.67%。龙蒿精油纳米胶囊呈较规则圆形，粒径约为40 nm，具有良好的热稳定性。龙蒿精油纳米胶囊对食品贮藏期间的防腐抗菌作用仍需进一步深入研究。