IL-37对氧化低密度脂蛋白诱导人冠状动脉内皮细胞分泌单核细胞趋化蛋白1的影响

谢燕丹，黄晓君，胡烈敏，谢思田

(1.汕头大学医学院第一附属医院心血管内科，广东 汕头 515041；2.汕头大学医学院，广东 汕头 515041；3.汕头大学医学院第二附属医院烧伤整形外科，广东 汕头 515041)

动脉粥样硬化(atherosclerosis，AS)是心脑血管疾病尤其是冠心病的主要病理基础。AS是一种弥漫性、全身性血管慢性炎症反应，可导致心、脑、肾等重要器官功能受损，其主要病理过程与炎症反应密切相关。氧化低密度脂蛋白(oxidizedlow density lipoprotein，ox-LDL)贯穿 AS 的发生和发展过程，损伤血管内皮功能，促进多种炎症因子分泌，促使巨噬细胞逐渐转化为泡沫细胞，吞噬脂质，形成脂质斑块[1-2]。在ox-LDL促分泌的众多炎症因子中，趋化因子是一大类可以被诱导的促炎症细胞因子。单核细胞趋化蛋白1(monocyte chemoattractant protein-1，MCP-1)是趋化因子中的一员。MCP-1 与趋化因子受体结合后，趋化和激活单核细胞以及其他免疫细胞，促进炎症反应[3-4]。

目前，炎症反应在AS起始、进展，以及斑块的破裂、血栓形成等全过程中所起的关键性作用已获得广泛共识。因此，恢复抗炎平衡可能有助于稳定AS 进展，甚至逆转AS 进程。越来越多的证据表明，白细胞介素37(interleukin-37，IL-37)可显著改变促炎性细胞因子的表达，从而减弱动脉粥样硬化斑块的形成[5]。故本研究探讨IL-37对ox-LDL 诱导人冠状动脉内皮细胞(human coronary artery endothelial cells, HCAECs)分泌 MCP-1 的影响，为临床应用IL-37治疗AS提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 主要试剂

HCAECs 及其培养基、牛血浆纤连蛋白、胎牛血清、青霉素、链霉素、内皮细胞因子等购自美国ScienCell 公司，ox-LDL、二甲基亚砜、MTT购自美国 Sigma 公司，siIL-37 mRNA 及 IL-37b 过表达质粒购自上海吉玛基因公司，TRIzol、Lipofectamine®3000 Reagent、Opti-Men 等购自美国Life Technologies 公司，PrimeScript RT Master Mix、SYBR Premix Ex TaqTM及柱式法 Total RNA 提取试剂盒购自日本Takara 公司，MCP-1 ELISA 试剂盒购自上海碧云天生物科技有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 细胞培养按HCAECs 培养说明书操作要求，将25 cm2培养瓶表面按2 μg/cm2预处理牛血浆纤连蛋白，放置于培养箱中过夜备用。将HCAECs 自液氮罐中取出，快速置于37 ℃恒温水浴箱中，融化后种植到培养瓶中。当细胞密度为5 000/cm2时，置37 ℃，体积分数为5%的CO2培养箱中培养，次日换液，此后隔2 d换液1次，细胞融合达70%时，隔1 d 换液1 次，至细胞融合达90%时进行细胞传代。选取第5代细胞进行相关实验操作。

1.2.2 细胞转染及实验分组第5代HCAECs接种于24 孔板上，细胞密度为4×104/孔，以内皮细胞完全培养基培养，次日细胞融合达80%～90%时按Lipofectamine®3000 Reagent 说 明书进 行 转染 操作。HCAECs 经 siIL-37 mRNA 或 IL-37b 过表达质粒转染 24 h 后，再用 80 μg/mL ox-LDL 处理 24 h，同时设置空白对照组、未转染ox-LDL 处理组、siRNA 阴性对照组、空白质粒组。除空白对照组外，其余各组均用80 μg/mL ox-LDL处理。IL-37b过表达质粒每孔用量为500 ng，siIL-37 mRNA 每孔终浓度为40 nmol/L。

1.2.3 MTT法检测细胞的增殖各组细胞消化后制成细胞混悬液，调整细胞密度为1×105/mL，每孔加入100 μL细胞悬液，接种于96孔细胞培养板中，放于培养箱中培养，分别培养2、24 h后，每孔加入20 μL 0.5% MTT 溶液，继续培养4 h 后终止培养，吸去孔内的培养液，每孔加入150 μL二甲基亚砜，于摇床上低速振荡10 min，使结晶物充分溶解，用Multiskan Ascert 酶联免疫检测仪(赛默飞世尔科技公司)测量各孔490 nm 的光密度(D)。同时设置调零孔(MTT、培养基、二甲基亚砜)和对照孔(细胞、MTT、培养基、二甲基亚砜)。比较各组细胞增殖情况。

1.2.4 MCP-1 mRNA 表达的检测RT-PCR 法检测各组细胞MCP-1 mRNA 的表达。操作步骤按Takara 公司的实时荧光定量反转录试剂盒的说明书进行：37 ℃ 15 min(反转录反应)，85 ℃ 5 s(反转录酶失活反应)。采用两步法PCR反应程序：95 ℃预变性30 s，95 ℃变性5 s，60 ℃延伸及退火30 s，共40 个循环。于每个循环的延伸阶段采集荧光信号。反应结束后做95 ℃的熔解曲线分析。每个样品设3 个复孔，MCP-1 mRNA 的相对表达量用 2-ΔCT×1 000表示。MCP-1基因上游引物：5′-CATAGCAGCCACCTTCATTCC-3′；MCP-1基因下游 引 物 ： 5′-TCTGCACTGAGATCTTCCTATTGG-3′。GAPDH上游引物：5′-CTGGGAGGAGAAGAT GC；GAPDH下游引物：ACCTTTGTTCCACGACC CATAG-3′。

1.2.5 MCP-1 蛋白表达的测定ELISA 法检测各组细胞培养液上清中MCP-1蛋白水平。具体步骤参照试剂盒说明书：配置标准品并绘制标准曲线；设置空白孔，分别将样品及不同浓度标准品加入相应孔中(100 μL/孔)；用封板膜封住反应孔，室温孵育120 min；洗板5 次，拍干；加入生物素化抗体，100 μL/孔，室温孵育60 min；洗板5 次， 拍干。 加入辣根过氧化物酶标记Streptavidin，100 μL/孔，室温避光孵育 20 min；洗板5 次，拍干；加入显色剂TMB 溶液，100 μL/孔，室温避光孵育15 min；加入终止液50 μL/孔，混匀后立即测量D(450)值。

1.3 统计学分析

应用SPSS 21.0统计软件进行分析，符合正态分布的计量资料以xˉ±s表示，两组间比较采用LSD-t检验，多组间比较采用单因素方差分析；以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组细胞增殖能力比较

各组细胞培养24 h 后，细胞的增殖能力的差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。

表1 各组细胞培养24 h后的增殖能力比较 (±s)

表1 各组细胞培养24 h后的增殖能力比较 (±s)

组别空白对照组未转染ox-LDL处理组siIL-37 mRNA组siRNA阴性对照组IL-37b过表达质粒组空白质粒组D(490)0.417±0.011 0.395±0.005 0.404±0.005 0.404±0.006 0.403±0.003 0.411±0.007

2.2 各组细胞MCP-1 mRNA的表达

未转染ox-LDL 处理组细胞内MCP-1 mRNA的表达与对照组相比增加(P<0.05)。siIL-37 mRNA组的MCP-1 mRNA 与siRNA 阴性对照组相比增加(P<0.01)。IL-37b 过表达质粒组的MCP-1 mRNA与空白质粒组相比减少(P<0.05)。见图1。

2.3 各组细胞培养液上清中MCP-1蛋白的水平

未转染ox-LDL 处理组细胞培养液上清中的MCP-1 蛋白的分泌量与对照组相比有增加(P<0.05)。siIL-37 mRNA 组的 MCP-1 蛋白分泌量较siRNA 阴性对照组增加(P<0.01)。IL-37b 过表达质粒组的MCP-1 蛋白分泌量较空白质粒组减少(P<0.05)。见图2。

图1 各组细胞MCP-1 mRNA的表达

图2 各组细胞培养液上清中MCP-1蛋白的水平

3 讨论

IL-37属于白细胞介素1家族成员，已被证实为固有炎症和免疫应答的一种天然抑制因子[6]，具有抗炎和免疫抑制作用，是一种炎症负性调控因子[7]。Ji等[8-10]研究发现，在AS斑块及AS患者的血液循环中，IL-37水平均升高。外源性IL-37可抑制DC细胞的成熟并诱导T调节细胞反应，从而减轻ApoE−/−小鼠的AS症状。Liu等[11]研究发现IL-37转基因ApoE−/−小鼠及ApoE−/−小鼠，发现内源性IL-37能够抑制ApoE−/−小鼠T调节细胞相关炎性因子的表达，如下调了TNF-α、IL-6、IL-1β、IL-12β和IFN-γ等的表达水平，IL-37能够抑制DC细胞在体内及体外的浸润和活化，IL-37发挥抗炎作用的机制为IL-37 抑制DC 细胞经IL-1R8-TLR4-NF-κB通路获得活化功能，在AS模型ApoE−/−小鼠体内，可观察到AS 斑块的缩小。McCurdy 等[12]的研究发现，IL-37 能促使巨噬细胞由炎性特性的M1 亚型转为具有抗炎特性的M2 亚型，从而发挥IL-37在AS过程中的抗炎作用。本研究发现，ox-LDL刺激正常状态HCAECs，细胞培养上清可检测到MCP-1 蛋白的分泌量增加，RT-PCR 检测也发现MCP-1 mRNA 的增加，提示ox-LDL 能够促使HCAECs 发生炎性反应。在本研究中，IL-37b 过表达质粒组细胞内MCP-1 mRNA 合成减少，细胞培养上清液中MCP-1 蛋白水平也下降。而应用siRNA 技术，内皮细胞IL-37基因沉默后，受到ox-LDL刺激后内皮细胞MCP-1 mRNA和蛋白水平均较siRNA阴性对照组增加。这提示IL-37作为抗炎症因子可以下调HCAECs 经ox-LDL 刺激后MCP-1的表达。

综上所述，本研究发现IL-37 对ox-LDL 诱导HCAECs分泌MCP-1有抑制作用。针对ox-LDL参与的AS，IL-37 拮抗炎性反应有可能成为临床治疗的关键措施。