HPLC法比较5种产地掌叶大黄蒽醌类成分含量

张楠楠，汪海斌，吕光达

(1 亳州市产品质量监督检验所，安徽 亳州 236800；2 国家中药材产品质量监督检验中心，安徽 亳州 236800；3 亳州含量无忧中药材检测有限公司，安徽 亳州 236800)

中药大黄为寥科植物掌叶大黄RheumpalmatumL.、唐古特大黄RheumtanguticumMaxim, ex Balf. 或药用大黄RheumofficinaleBaill.的干燥根和根茎[1]。性寒，味苦，归脾、胃、大肠、肝、心包经，是我国传统的四大中药之一。具有泻下攻积，清热泻火，凉血解毒，逐瘀通经，利湿退黄之功效。现代药理研究表明，大黄有调节胃肠功能、抗病原微生物、抗炎、保护心脑血管、抗肿瘤、保肝利胆等作用[2-5]。

大黄药材所含化学成分众多，主要有蒽醌类、蒽酮类、二苯乙烯类、苯丁酮类、鞣质类、多糖类等成分，其中，蒽醌类成分是其主要活性物质[6-8]。众所周知，中药的质量差异与其来源及产地有着很深的联系。已报道的关于大黄药材的相关文献中[9-10]，掌叶大黄和唐古特大黄质量较好，药用大黄质量较差。而产地不同，大黄的质量差异也较大。本实验采用HPLC法，对15批不同产地的掌叶大黄中游离蒽醌与总蒽醌的含量进行测定，并对测定结果进行聚类分析和主成分分析，以期为大黄的质量评价及深入研究提供参考。

1 实 验

1.1 材 料

1.1.1 试 材

掌叶大黄药材共15批样品由华润三九医药股份有限公司提供，均经安徽中医药大学周建理教授鉴定为掌叶大黄RheumpalmatumL.的干燥根和根茎。详细信息见表1。对照品芦荟大黄素(批号110795-201609)；大黄酸(批号110757-201607)；大黄素(批号110756-201512)；大黄酚(批号110796-201520)；大黄素甲醚(批号110758-201415)来自中国食品药品检定研究院。乙腈、甲醇、磷酸均为色谱纯，其余试剂为分析纯，水为超纯水。

表1 掌叶大黄详细信息一览表Table 1 List of detailed information of Rheum palmatum

1.1.2 仪 器

高效液相色谱仪，美国Waters e2695；Waters XBridge C18色谱柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；KQ-205 型数控超声清洗器，昆山超声仪器有限公司；XMTD-7000电热恒温水浴锅，北京市永光明医疗仪器有限公司；R-215旋转蒸发仪，瑞士布奇有限公司；AX224ZH万分之一天平，奥豪斯仪器(常州)有限公司；XPE56C百万分之一天平，美国赛多利斯有限公司。

1.2 方 法

1.2.1 色谱条件

色谱柱：Waters XBridge C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流动相：乙腈(A)-0.1%磷酸溶液(B)，线性梯度洗脱(0～5 min，70%A；5～6 min，70%→85% A；6～17 min，85% A；17～18 min，85%→70% A；18～22 min，70% A)；流速：1.0 mL/min；检测波长：254 nm；柱温：30 ℃；进样体积：10 μL。

1.2.2 溶液的制备

1.2.2.1 混合对照品溶液

精密称取芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚适量，加甲醇分别制成每1 mL含芦荟大黄素87.4 μg、大黄酸83.3 μg、大黄素80.7 μg、大黄酚81.8 μg、大黄素甲醚43.4 μg的对照品母液；分别精密量取上述对照品母液各2 mL，混匀，即得每1 mL中含芦荟大黄素17.5 μg、大黄酸16.7 μg、大黄素16.1 μg、大黄酚16.4 μg、大黄素甲醚8.7 μg的混合对照品储备液。

1.2.2.2 游离蒽醌供试品溶液

取本品粉末(过四号筛)约0.5 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇25 mL，称定重量，加热回流1小时，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液作为供试品溶液。

1.2.2.3 总蒽醌供试品溶液

取本品粉末(过四号筛)约0.15 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇25 mL，称定重量，加热回流1 h，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过。精密量取续滤液5 mL，置烧瓶中，挥去溶剂，加8%盐酸溶液10 mL，超声处理2 min，再加三氯甲烷10 mL，加热回流1 h，放冷，置分液漏斗中，用少量三氯甲烷洗涤容器，并入分液漏斗中，分取三氯甲烷层，酸液再用三氯甲烷提取3次，每次10 mL，合并三氯甲烷液，减压回收溶剂至干，残渣加甲醇使溶解，转移至10 mL量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，滤过，取续滤液作为供试品溶液。

2 结果与讨论

2.1 线性关系考察

精密吸取0.5、2、8、12、16 μL上述对照品母液，注入液相色谱仪，以对照品质量浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，得芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚的线性回归方程：Y=4791X-35356，R2=0.9999；Y=3376.4X-37273，R2=0.9999；Y=3660.2X-22264，R2=0.9999；Y=5079.3X-33574，R2=0.9999；Y=869.41X-6965，R2=0.9998；结果表明，芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚进样量分别在43.7～1398.4、41.65～1332.8、40.35～1291.2、40.9～1308.8、21.7～694.4 ng 区间线性关系良好。

2.2 精密度实验

取上述混合对照品溶液，按“1.2.1”色谱条件连续测定。计算芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚峰面积的RSD分别为0.46%、0.55%、0.77%、0.61%、0.98% (n=6)，说明仪器精密性良好。

2.3 稳定性实验

取11号样品，按“1.2.2.2”和“1.2.2.3”项下方法各制备1份供试品溶液，于制备后4、8、12、16、24 h按“1.2.1”色谱条件测定，计算游离蒽醌中芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚峰面积的RSD分别为0.43%、0.55%、0.51%、0.62%、0.87%，总蒽醌中芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚面积的RSD 分别为0.76%、0.64%、0.80%、0.75%、0.93%，结果说明24 h内供试品溶液稳定性良好。

2.4 重复性实验

取11号样品，按“1.2.2.2”和“1.2.2.3”项下方法制备供试品溶液6份，按“1.2.1”色谱条件测定。计算游离蒽醌中芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚含量平均值的RSD分别为0.52%、0.67%、0.63%、0.89%、1.17%；总蒽醌中芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚含量平均值的RSD分别为0.66%、0.71%、0.69%、0.97%、1.33%，表明本方法的重复性良好。

2.5 加样回收率实验

精密称取已知含量的11号掌叶大黄样品0.2 g共6份，分别置具塞锥形瓶中，精密加入混合对照品溶液适量，按“1.2.2.2”项下方法制备供试溶液，按“1.2.1”色谱条件进样测定，计算游离蒽醌的回收率。

精密称取已知含量的11号掌叶大黄样品0.1 g 共6份，分别置具塞锥形瓶中，精密加入混合对照品溶液适量，按“1.2.2.3”项下方法制备供试溶液，按“1.2.1”色谱条件进样测定，计算总蒽醌的回收率。

回收率计算结果显示，游离蒽醌和总蒽醌的加样回收率为96.8%～102.1%，RSD值为0.83%～1.4%，表明本方法的准确度良好。

2.6 样品含量测定

取15批不同产地的掌叶大黄进行色谱分析，色谱图见图1。计算掌叶大黄中游离蒽醌和总蒽醌含量后，再计算结合蒽醌含量(总蒽醌含量-游离蒽醌含量)，结果见表2。

图1 混合对照品及11号掌叶大黄样品HPLC色谱图Fig.1 HPLC chromatograms of mixed reference substances and Rheum palmatum sample No.11

结合表2可以看出，不同产地的掌叶大黄蒽醌类成分含量差异较大，甘肃宕昌掌叶大黄中游离蒽醌含量较高，结合蒽醌含量较低；青海玉树与甘肃陇西掌叶大黄结合蒽醌含量较高，可能受到地理、气候等因素的影响，不同产地掌叶大黄蒽醌类成分的富集程度也有所不同。

表2 样品含量测定结果(n=2)Table 2 Determination results (n=2) (mg·g-1)

2.7 聚类分析

本实验根据测得样品的游离蒽醌、总蒽醌和结合蒽醌类成分的含量，将含量数据导入SPSS 19.0 软件进行聚类分析，结果见图2。聚类阈值为5时，15批样品分为4小类，即甘肃宕昌，陕西城固，青海玉树，甘肃礼县、甘肃陇西。阈值为10时，15批样品分为3类，即甘肃宕昌为一类，青海玉树为一类，陕西城固、甘肃礼县、甘肃陇西为一类。阈值为15时，掌叶大黄样品可以分为两大类，即甘肃宕昌掌叶大黄为一类，其它产地掌叶大黄为一类。结果表明，除了甘肃礼县和甘肃陇西两个产地掌叶大黄有交叉外，产地相同的掌叶大黄样品聚为一类，其蒽醌类成分含量相似。不同产地掌叶大黄的蒽醌类成分含量与其产地生长环境存在着一定的联系，甘肃礼县和甘肃陇西掌叶大黄样品，因海拔、产地相近，两类差异较小；陕西城固海拔与甘肃陇西、礼县比较相近，三者产地大黄差异较小；甘肃宕昌、青海玉树掌叶大黄可能因海拔与其它三地相差较大，各自聚为一类。

图2 15批掌叶大黄聚类分析图Fig.2 Hierarchical clustering analysis of 15 batches of Rheum palmatum

2.8 主成分分析(PCA)

将含量数据导入SIMCA 13.0 软件，以掌叶大黄中的游离蒽醌、总蒽醌和结合蒽醌类成分含量为X 变量，15个批次的掌叶大黄为Y 变量，将数据标准化后进行PCA，见图3。甘肃礼县与甘肃陇西两个产地掌叶大黄在分布上有区域交叉，陕西城固掌叶大黄又与甘肃礼县、陇西的较接近，甘肃宕昌、青海玉树掌叶大黄与其它产地的较为疏远，海拔高度越接近的居群，其主成分空间的分布位置也越接近，这也与上述聚类分析的结果相吻合。

图3 15批掌叶大黄的PCA 图Fig.3 The PCA score plot of 15 batches of Rheum palmatum

2.9 偏最小二乘判别分析(PLS-DA)

图4 15批掌叶大黄的PLS-DA 得分图Fig.4 The PLS-DA score plot of 15 batches of Rheum palmatum

图5 15批掌叶大黄的PLS-DA 载荷图Fig.5 The PLS-DA Load vector diagram of 15 batches of Rheum palmatum

图6 蒽醌类成分的贡献值(VIP 值)Fig.6 Variable importance of the anthraquinone components in the project value(VIP)

3 讨 论

3.1 流动相比例的考察

本实验分别比较了流动相乙腈-0.1%磷酸溶液(85:15)、乙腈-0.1%磷酸溶液(80:20)等度洗脱以及乙腈-0.1%磷酸溶液(70:30)梯度洗脱比例，选用等度洗脱流动相比例时，大黄样品游离蒽醌中的芦荟大黄素峰易受到杂峰干扰，分离效果较差，而梯度洗脱比例则能将芦荟大黄素峰很好的分离，综合考虑到分析蒽醌类化合物的含量，选择乙腈-0.1%磷酸溶液(70:30)梯度洗脱作为流动相。

3.2 气温、海拔对大黄蒽醌类成分的影响

特有的气候因子条件有利于药材活性成分的形成和积累，从而影响药材品质。有研究表明，气温是影响掌叶大黄品质主要的气候因子之一，对掌叶大黄化学成分含量的富集起到至关重要的作用[11]。本实验研究发现在大黄的5个不同产地中，青海玉树与甘肃陇西两地掌叶大黄总结合蒽醌含量较高，结合5个产地的年平均气温分析，青海玉树与甘肃陇西的年平均气温较其它三个产地低，推测可能是掌叶大黄药材在低气温的影响下，更有利于其富集结合蒽醌类化合物。

同时，也有相关研究发现，大黄化学成分与海拔高度之间显著相关[12-14]。至于其形成原因，认为是不同海拔高度的土壤、光照、温度和湿度等环境因素综合作用的结果。本实验的聚类分析和主成分分析结果也表明，同一海拔的掌叶大黄药材中蒽醌类成分含量间存在相似性，海拔接近的甘肃礼县、陇西两个产地掌叶大黄在分布上有区域交叉，这可能从另一方面提示了海拔对掌叶大黄药材品质的影响。

3.3 不同产地大黄蒽醌类组分含量的差异可能导致其不同功效活性差异

结合大黄相关药理学研究文献表明，大黄中游离蒽醌类成分与其“清热解毒”功效相关[15]，结合蒽醌类成分则与其“泻下攻积”功效相关[16-17]，因此，不同产地大黄在蒽醌类组分含量上的差异，很有可能会导致其在不同功效上产生差异。以此推断，在本次实验的5个产地掌叶大黄中，游离蒽醌类化合物含量最高的甘肃宕昌掌叶大黄，其清热解毒功效最强；结合蒽醌类化合物含量较高的青海玉树与甘肃陇西掌叶大黄，其泻下作用可能较强。

4 结 论

本研究建立了HPLC法测定不同产地掌叶大黄药材中蒽醌类成分含量的方法，同时对掌叶大黄的蒽醌类成分含量进行了多元统计分析，15批掌叶大黄的聚类分析及主成分分析说明不同产地的掌叶大黄的蒽醌类化学成分与其产地、海拔等环境存在着一定的相关性，偏最小二乘判别分析筛选出总大黄酸、结合蒽醌大黄酸、结合蒽醌大黄素的VIP值均>1.2，表明这几个成分可能是15批掌叶大黄样品蒽醌类成分的主要差异标志物，从而为大黄的质量评价提供了参考依据。