番石榴叶抑制酪氨酸酶作用机制研究

孙晓梦，林东明，杨弘，王禕，王凯晗，王春丽，*

（1.华东理工大学药学院，上海200237；2.制药工程与过程化学教育部工程研究中心，上海200237；3.上海市新药设计重点实验室，上海200237）

从酪氨酸和L-多巴代谢为真黑素和褐黑素，作为唯一明确的黑色素代谢酶，酪氨酸酶在黑色素形成过程的多个环节中，发挥着至关重要的限速作用[1]。应用酪氨酸酶抑制剂，通过抑制酪氨酸酶的活性，阻断黑色素的合成反应链，减少其在皮肤内的生成从而达到祛斑增白的效果。因此，美白是酪氨酸酶抑制剂主要应用方向之一。美白化妆品市场近年来日趋活跃，销量快速增长。美白剂按来源分合成、生物发酵和动植物提取，其中由合成品及生物发酵所制得的美白剂，由于纯度高、颜色浅和性能稳定而占据美白剂主要市场。而植物来源的美白剂用于迎合人们的安全需求而成为近年来研究的焦点。在化妆品活性成分筛选时，获得兼具美白与抗氧化作用的活性物质是理想目标，即酪氨酸酶抑制剂同时表现出良好的清除体内自由基的作用，如熊果苷、VC等[2]。目前，已有研究表明番石榴叶中黄酮类化合物具有显著抗氧化活性[3]，因此，经初筛研究，在证实番石榴叶水提液兼具良好的酪氨酸酶抑制作用以及自由基清除作用后，本文旨在探究番石榴叶水提液抑制酪氨酸酶的作用机制。一般来说，药物对酪氨酸酶抑制机制可以分为竞争型、非竞争型、混合型或者可逆型、不可逆型[4]，本文将通过试验探究其抑制机制的具体类型。

1 材料与方法

1.1 试验材料与仪器

试验材料与仪器见表1。

表1 试验材料与仪器Table 1 The main raw material and equipment

1.2 试验方案

1.2.1 提取液制备

番石榴叶粉碎过30目筛，准确称取5.0 g，以水为溶剂，取料液比 1 ∶10（g/mL），加热回流 1.0 h，收集上层清液。滤渣加入同体积水，继续加热回流1.0 h。合并两次提取液，沉清，抽滤，所得滤液定容至100 mL的容量瓶中[5]。制得中药（生药）提取液的浓度约为50 mg/mL。

1.2.2 初速度值计算

试验中分别用 0.25、0.5、1.0、1.5、2.0 mmol/L 的不同浓度的L-多巴溶液，同时改变番石榴叶水提物的浓度 0、2、4、6、8、10 mg/mL，按体积比 1 ∶1 ∶1 要求加入磷酸缓冲盐溶液（phosphate buffered saline，PBS）、L-多巴溶液、番石榴叶提取液，28℃下水浴10 min后，加入酪氨酸酶，用紫外-可见分光光度计测定其吸光度值进行动力学分析，绘制出酶反应体系随时间的线性增长曲线，其斜率为初始速度值。取平行试验3次的平均值。

1.2.3 抑制类型判定

动力学研究表明，酶抑制机制类型不同，其动力学参数的变化也是有规律的，表现在米氏常数Km值以及最大反应速率Vm值[6]。由动力模型Lineweaver-Burk双倒数方程[7]绘制图，竞争抑制类型表现为直线与横坐标轴相交。抑制剂浓度越大，直线的斜率越大，而纵轴的截距保持不变。即动力学参数表现为Km值增加并且Vm值保持不变。非竞争型抑制类型也表现为一组交点在横坐标轴上的直线[8]，但抑制剂浓度越大，Km值不变，Vm值变小。混合型抑制类型表现为一组交点在第二象限的直线抑制剂浓度增大时，Km值增大，Vm值减小。

1.2.4 抑制常数测定

酶活力未改变，L-多巴浓度发生变化，测定不同浓度番石榴叶水提物对酶活力的影响。以L-多巴浓度为横坐标、酪氨酸酶初速度为纵坐标绘制关系图[9]，纵坐标绘制一组Lineweaver-Burk双倒数直线图，其中横坐标为L-多巴浓度的倒数、纵坐标为酪氨酸酶初速度的倒数，比较Km值和Vm值的变化规律，由此判断抑制机制类型。以番石榴叶水提物浓度为横坐标、米氏方程斜率为纵坐标作图，抑制常数KI为拟合的直线斜率；以番石榴叶水提物浓度为横坐标、米氏方程截距为纵坐标作图，抑制常数KIS为拟合直线的截距[10]。

目前，竞争型、非竞争型以及混合型抑制类型的动力学模型研究较为完善[11]，各动力学模型Lineweaver-Burk方程分别为：

式中：CI为酪氨酸酶抑制剂浓度，mg/mL；CS为底物（L-多巴）浓度，mmol/L；Km为表观米氏常数，mmol/L；KI为酪氨酸酶抑制剂对酶的抑制常数，mg/mL；KIS为酪氨酸酶抑制剂对酶与底物的络合物的抑制常数，mg/mL；Vm为酪氨酸酶催化氧化的最大反应速率，△A/min；V为酪氨酸酶催化氧化的反应速率，△A/min。

2 结果与讨论

2.1 酶活力测定

番石榴叶水提液浓度对酪氨酸酶的影响见图1。

图1 番石榴叶水提液浓度对酪氨酸酶的影响Fig.1 The effect of guava leaf water extract on activity of tyrosinase

固定L-多巴浓度和酶活力，用1.2.3方法测定不同浓度番石榴叶水提物对酪氨酸酶活力的影响，以时间为横坐标、吸光度为纵坐标，绘制酪氨酸酶动力学曲线[12]。由图1可知，随着番石榴叶水提物的浓度逐渐增大，直线斜率逐渐减小，表明L-多巴被酪氨酸酶催化氧化的速率逐渐减小，从而证明了番石榴叶水提物对酪氨酸酶具有一定的抑制作用。

2.2 初速度值

改变底物L-多巴的浓度以及番石榴叶水提物的浓度，获得酪氨酸酶催化氧化进程动力学曲线，通过其斜率来计算初速度值[13]，结果见表2。

表2 不同的底物浓度和提取物浓度下的酶反应初速度Table 2 Initial reaction velocity of tyrosinase-catalyzed reaction at different substrate concentrations and different extracts concentrations

2.3 抑制类型判定

基于表2中的试验数据，绘制了以提取物浓度为横坐标，初始速度为纵坐标的关系曲线如图2。

图2 不同浓度的番石榴叶提取液对酪氨酸酶初速度的关系图Fig.2 The effect on different concentrations of guava leaf water extract on tyrosinase initial reaction velocity

从图2中可以看出，初速度值随着L-多巴浓度的增大而增大，随着番石榴叶水提物浓度的增大而减小。结果表明，随着L-多巴浓度的增加，番石榴叶提取物对酪氨酸酶的抑制作用减弱，因而可以推断该抑制类型为竞争型[14]，即酪氨酸酶抑制剂和底物相互竞争以减弱酶催化氧化多巴的反应进程。

基于表2的试验数据，绘制以L-多巴浓度为横坐标、初速度为纵坐标的关系曲线，如图3。

图3 不同浓度的底物L-多巴对酪氨酸酶初速度的关系图Fig.3 The effect on different concentrations of substrate on tyrosinase initial reaction velocity

从图3中可以看出，底物浓度越大，酶活力越大，而不同浓度的番石榴叶水提物对不同浓度底物的酪氨酸酶均有不同程度的抑制作用。当番石榴叶水提物浓度超过4 mg/mL时，酶起止活力变化幅度逐渐减小，酶与番石榴叶水提物之间的相互作用趋于平稳。结果表明，番石榴叶水提取物是通过抑制酪氨酸酶的活性而不是直接使酶失活来降低其催化氧化效率。因此，可以推断番石榴叶水提取物对酪氨酸酶的抑制作用是可逆的[15]。

2.4 动力学分析

将表2中数据取倒数进行转换，得表3。

表3 番石榴叶水提物抑制酪氨酸酶的动力学分析Table 3 Dynamic analysis of diphenolase inhibited by guava leaf water extract

以L-多巴浓度的倒数为横坐标、初速度值的倒数为纵坐标，绘制出番石榴叶水提物抑制酪氨酸酶的Lineweaver-Burk双倒数直线，见图4。

由图4可看出直线在第二象限一个交点，并且番石榴叶水提物浓度越大，直线斜率Km越大，直线截距Vm越小，由酶抑制类型定律可知番石榴叶水提物抑制酪氨酸酶的类型为混合型[16]，即抑制剂既与底物和酪氨酸酶的络合物结合，也与底物竞争。

2.5 抑制常数测定

由图4得到各组直线的斜率与截距，经过拟合得到不同浓度番石榴叶水提物的米氏方程，其动力学参数见表4。番石榴叶水提物的酶抑制常数Kl的测定见图5，番石榴叶水提物的酶抑制常数Kls的测定见图6。

图4 番石榴叶抑制酪氨酸酶的动力学分析图Fig.4 Dynamic analysis of diphenolase inhibited by guava leaf water extract diphenolase

表4 番石榴叶水提物抑制酪氨酸酶的动力学参数Table 4 Kinetic parameters of diphenolase inhibited by guava leaf water extract

图5 番石榴叶水提物的酶抑制常数K1的测定Fig.5 Determination of inhibitory constant K1by guava leaf water extract on diphenolase

图6 番石榴叶水提物的酶抑制常数KIS的测定Fig.6 Determination of inhibitory constant KISby guava leaf water extract on diphenolase

表4可知，抑制常数KI=13.02 mg/mL、KIS=3.98 mg/mL，KI与KIS可以通过图5的直线斜率与图6的直线截距分别得出。KI值大于KIS，说明番石榴叶水提物对酪氨酸酶和底物多巴的络合物的抑制作用强于对游离态的酪氨酸酶的抑制作用[17]。各米氏方程的Km与Vm值由混合型抑制模型方程式（3）得出。由现有试验数据并结合已知的药物对酪氨酸酶抑制的机制，随着番石榴叶水提物浓度增大，Km增大，Vm一定程度减小，说明番石榴叶水提物抑制酪氨酸酶的类型较符合混合型[18]。

3 结论

本文考察了在番石榴叶水提物的影响下酪氨酸酶催化氧化的反应进程，并且探讨了番石榴叶水提物和底物L-多巴在不同浓度下分别对酪氨酸酶的初速度的影响，判断了番石榴叶水提物对酪氨酸酶的抑制类型。

3.1 番石榴叶水提物对酪氨酸酶的抑制作用显著

由番石榴叶水提物对酪氨酸酶活力影响的曲线图可知，反应进程直线的斜率随着番石榴叶水提物浓度的增大而明显减小，即酪氨酸酶的催化活性随着酶抑制剂浓度的增大而明显降低，表明番石榴叶水提物对酪氨酸酶的抑制作用较为显著。

3.2 番石榴叶水提物对酪氨酸酶的抑制作用可逆

由不同浓度的番石榴叶水提物、不同浓度的底物L-多巴分别与酪氨酸酶初速度的关系图可知，酪氨酸酶初速度值在底物浓度一定的情况下随着番石榴叶水提物浓度的增大而减小，在抑制剂浓度一定的情况下随着底物L-多巴浓度的增大而增大，酪氨酸酶并没有因为抑制剂的存在而失活，表明番石榴叶水提物通过降低酪氨酸酶的催化氧化反应活性来限制黑色素生成过程中的反应速率，并且抑制作用是可逆性的[19]。一般中药类型的酪氨酸酶抑制剂主要以可逆型为主，因其表征为解离平衡时酪氨酸酶抑制剂与酶或者酶和底物的络合物之间相互结合的可逆反应[20]。

3.3 番石榴叶水提物对酪氨酸酶的抑制作用类型为混合型

由番石榴叶水提物抑制酪氨酸酶的Lineweaver-Burk双倒数直线图可知，米氏方程直线的斜率随着番石榴叶水提物浓度的增大而增大，米氏方程直线的截距随着番石榴叶水提物浓度的增大而减小，即抑制剂浓度增大时，Km值增大，Vm值减小，且该组直线在第二象限相交于一点，完全符合混合型酪氨酸酶抑制特征，即番石榴叶水提物既可以与酪氨酸酶结合，也可以与酶和底物的络合物结合，从而抑制催化氧化反应进程而发挥美白作用。此外由抑制常数KI＞KIS可知，番石榴叶水提物对酪氨酸酶和底物多巴的络合物的抑制作用强于对游离态的酪氨酸酶的抑制作用。