玫瑰树碱促进NK细胞识别与杀伤非小细胞肺癌细胞的研究

阎学伟，龚陈媛,祝晓雯，胥孜杭，2，姚超,3，王莉新,3，朱诗国,3

(上海中医药大学 1.基础医学院、2.经方理论应用研究中心、3.免疫学与病原生物学教研室，上海 201203)

非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)在肺癌的组织学类型中占比最高，在所有肿瘤中，NSCLC致死率最高[1]。酪氨酸激酶抑制剂(tyrosine kinase inhibitor，TKI)、间变性淋巴瘤激酶(anaplastic lymphoma kinase, ALK)抑制剂等分子靶向药物先后进入临床应用，使各期NSCLC患者的生存期得到了很大提高[2]。但是，NSCLC的疗效依旧存在很大的上升空间，中晚期NSCLC治疗获益相对于早期依然非常有限[3]。寻求更加有效、作用更加持久的NSCLC疗法为当前研究热点。

随着对固有免疫系统的研究不断深入，固有免疫系统在肿瘤发生、发展中的重要地位被渐渐确立，与自然杀伤(natural killer，NK)细胞相关联的肿瘤免疫疗法也受到了关注。目前，针对NK细胞相关的抗肿瘤疗法，包括NK细胞、嵌合抗原受体-NK细胞(chimeric antigen receptor-NK cells，CAR-NK)、促NK细胞因子的回输等，另外，NK细胞抑制性受体抑制剂的应用也对NK细胞的抗肿瘤活性产生了积极作用[4]。

目前，通过使用天然化合物增强NK细胞抗肿瘤作用的报道尚不多见，玫瑰树碱(ellipticine，EPT)是一种来源于传统植物玫瑰树的吲哚并异喹啉类生物碱，对白血病、结肠癌、乳腺癌等肿瘤细胞都有抑制作用[5]。本研究旨在探讨EPT促进NK细胞识别和杀伤NSCLC细胞的作用，以期促进扩充基于药物治疗的NSCLC免疫疗法。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1药物与试剂 EPT(陶素化学公司，批号T4614)；DMSO(Amresco公司,批号0231)；胰酶、胎牛血清(Gibco公司)；DMEM高糖培养液、RPMI 1640培养液、青霉素/链霉素双抗、PBS缓冲液(Hyclone公司)；人重组白介素-2(PeproTech公司，批号200-02)；噻唑兰(Sigma Aldrich公司，批号M2128)；CCK8试剂盒(翊圣生物公司，批号ES60)；PE标记MICA/B抗体、APC标记HLA-ABC抗体(Biolegend公司，批号320906、311410，)；FITC标记CD56抗体、PE/Cy5 标记CD107α抗体、PE-Cy5同型对照抗体(BD公司，批号318304、555802、551497)；潮霉素B(Roche公司，批号 31282)；D-luciferin底物(PerkinElmer公司，批号 2591)；ATP检测Celltiter Glo®试剂盒(Promega公司，批号G7571)；γ-H2AX抗体(Abcam公司，批号26350)；DAPI(碧云天公司，批号C1002)。

1.1.2细胞株 人NSCLC H1299、A549细胞，由中国科学院上海生命科学研究院细胞库提供。A549-luciferase(A549-luc)和H1299-luciferase(H1299-luc)细胞，由上海中医药大学基础医学院免疫学与病原生物学教研室建立细胞株并提供。

1.1.3仪器 二氧化碳细胞培养箱(Thermo Scientific公司, 1300series A2)；激光共聚焦显微镜(ZESS公司, LSM 800 with Airyscan)；酶标仪(Bio Tek 公司, Synergy)；流式细胞仪(BD公司, Accuri C6)；倒置显微镜(OLYMPUS公司,CKX41)。

1.2 方法

1.2.1NK细胞扩增 从上海血液中心获人的外周血，经分离得到人的外周血单个核细胞(PBMCs)。使用新鲜或者冷冻的PBMCs通过与经辐照的基因工程细胞mbIL-21-CD137L-K562，在含有1×105U·L-1的IL-2的RPMI 1640培养基中共培养，在5%CO2，37 ℃下扩增2周，NK细胞标志为CD3-CD56+。

1.2.2MTT法检测EPT对肺癌细胞增殖的影响 A549和H1299细胞，胰酶消化后，制备成单细胞悬液，铺于96孔板，细胞浓度为3 000个细胞每孔，在37 ℃、5%CO2培养箱内过夜后，加入不同浓度的EPT(0.125、0.25、0.5、1、2、4、8 μmol·L-1)，设立DMSO溶剂对照组和空白组，每组设3复孔。培养24、48、和72 h后，每孔加入20 μL MTT溶液(5 g·L-1)，在培养箱中反应4 h后，弃上清，每孔加入150 μL DMSO溶液，酶标仪检测490 nm吸光度。计算细胞活力/%：(实验组OD值-空白组OD值/对照组OD值-空白组OD值)×100%

1.2.3免疫荧光检测EPT对肺癌细胞DNA的影响 A549、H1299细胞消化，调整细胞密度为1×108个·L-1，铺免疫荧光成像专用皿，每皿加入1 mL细胞悬液，置于37 ℃、5%CO2培养箱内培养过夜。每皿加入1 mL终浓度为0、1、2 μmol·L-1的EPT培养24 h后，PBS洗1遍，每皿加入1 mL 4%多聚甲醛室温固定10 min。PBS清洗1遍，加入1 mL破膜剂(0.2%Triton X-100+0.5%BSA PBS)20 min进行破膜。PBS洗1遍，加1 mL 3%马血清室温封闭1 h。PBS洗1遍，每皿加80 μL一抗(1 ∶200，mouse anti human γ-H2AX)4 ℃过夜后PBS洗3遍，加入100 μL二抗(1 ∶350，goat anti mouse Alexa Fluro 488)室温避光孵育1 h。PBS洗3遍，加入120 μL DAPI(1 ∶2 000)室温避光染色10 min。PBS洗3遍，每皿加入1mL PBS后使用激光共聚焦25倍镜进行拍摄(Alexa Fluro 488及DAPI荧光)。

1.2.4CCK8法检测EPT对NK细胞增殖的影响 取NK细胞，调整细胞浓度为5×108个·L-1。将NK细胞悬液加入96孔板，100 μL每孔。加入终浓度分别为0.125、0.25、0.5、1、2、4、8 μmol·L-1的EPT，设DMSO对照组和空白组，每组3复孔。于培养箱内培养24 h、48 h后每孔加入20 μL CCK8溶液，4 h后，酶标仪上检测450 nm处吸光度。计算细胞活力/%：(实验组OD值-空白组OD值/对照组OD值-空白组OD值)×100%

1.2.5化学发光法(ATP法)检测EPT对NK细胞杀伤功能的影响 A549和H1299细胞，经胰酶消化制备成单细胞悬液，调整细胞浓度1×108个·L-1, 将NK细胞取出调整浓度，以NK细胞与肿瘤细胞的效靶比为1 ∶1或2 ∶1进行和药物于白底96孔板共孵育。分为单肿瘤细胞组，单NK细胞组和肿瘤细胞+NK细胞组，每组3复孔。EPT(终浓度0、0.25、0.5、1、2 μmol·L-1)，每孔细胞悬液加药物总体积100 μL，在37 ℃、5%CO2培养箱内培养24 h后。每孔加入底物100 μL，反应10 min。使用酶标仪测定。 计算杀伤效力/%：1-[(NK细胞+肿瘤细胞组)-(单独NK细胞组)]/单独肿瘤细胞组×100%

1.2.6 化学发光法(Luciferase法)检测EPT对NK细胞杀伤肺癌细胞作用的影响使用潮霉素B进行抗性筛选处理培养A549-luciferase(A549-luc)和H1299-luciferase(H1299-luc)细胞，调整细胞浓度1×108个·L-1。同时将NK细胞取出调整浓度，以NK细胞与肿瘤细胞的效靶比分别为1 ∶1和2 ∶1进行和药物于白底96孔板共孵育。设定3个组，Spontaneous(单肿瘤细胞组)，肿瘤细胞+NK细胞组和Maximum组。即DMSO组和1 μmol·L-1、2 μmol·L-1的EPT组，Spontaneous组是加培养基，Maximum组是2%TritonX-100，每孔终体积200 μL，培养24 h后，每孔加入2 μL luciferase荧光底物，用酶标仪检测。计算杀伤效力/%：1-[(NK细胞+肿瘤细胞组)-Maximum组)/(Spontaneous组-Maximum组)]×100%

1.2.7 流式细胞术检测EPT对NK细胞脱颗粒作用的影响A549和H1299细胞，胰酶消化后，制备成单细胞悬液加入6孔板，细胞浓度3×108个·L-1。每孔需2 mL细胞培养液。培养箱内过夜，加入浓度分别为0、1、2 μmol·L-1的EPT。加药24 h后取出6孔板，将细胞消化并计数。与NK细胞效靶比为1 ∶1共孵育，以细胞数为2×105个，加入到48孔板中。向单NK细胞组和NK细胞+肿瘤细胞组，加入CD107α抗体和同型对照抗体孵育4 h。收集细胞于1.5 mL EP管中，用wash buffer洗两遍。每个EP管再加入CD56抗体的，置于4 ℃冰箱孵育30 min。用wash buffer溶液洗两遍，每孔加入200 μL的PBS，用流式细胞仪检测。

1.2.8 流式细胞术检测EPT对肺癌细胞MICA/B与HLA-ABC表达的影响取A549和H1299细胞，胰酶消化后，制备单细胞悬液，以细胞密度为3×108个·L-1加入6孔板。每孔需2 mL细胞培养液。在37 ℃、5%CO2培养箱内培养过夜，d2加入浓度分别为0、1、2 μmol·L-1的EPT，37 ℃、5%CO2培养24 h后。将细胞消化并计数。每管1×105个/50 μL细胞加入1.5 mL的EP管中。每管加入PE-MICA/B和APC-HLA-ABC抗体，同时设同型对照,于4 ℃冰箱染色30 min。用wash buffer洗一遍，再加入200 μL wash buffer溶液，用流式细胞仪检测。

2 结果

2.1 EPT对NSCLC细胞和NK细胞的增殖的影响MTT结果显示EPT可以明显抑制NSCLC A549和H1299细胞的增殖(P<0.05)，并且有浓度和时间依赖性，如Fig 1 A、B所示。 A549细胞在24、48、72 h的IC50分别是12.06、3.76、1.65 μmol·L-1。H1299细胞在24、48、72 h的IC50分别是12.9、8.56、4.80 μmol·L-1。CCK-8的实验结果显示，EPT对NK细胞的增殖抑制作用较弱，如Fig 1 C所示。其在24，48 h的IC50是112.71、72.03 μmol·L-1。

Fig 1 Effect of EPT on proliferation of non-small cell lung cancer cells and NK cells n=3)A-B: A549 and H1299 cells were treated with different concentrations of EPT for 24 h, 48 h and 72 h, and cell viability was measured by MTT assay. C: NK cells were treated with different concentrations of EPT shown in the figure for 24 h, 48 h, the activity of NK cells was detected by CCK8; *P<0.05,**P<0.01 vs vehicle group.

2.2 EPT对肺癌细胞DNA的影响Fig 2显示，EPT能够诱导NSCLC A549和H1299细胞产生DNA损伤。EPT处理A549、H1299细胞24 h后，免疫荧光检测细胞中DNA损伤的标志物γ-H2AX的表达增加(P<0.01)。

Fig 2 EPT induces DNA damage in A549 and H1299 cellsA: Immunofluorescence detection of γ-H2AX expression in A549 cells treated with EPT (culture time: 24 h). B: Percentage of γ-H2AX positive area in A549 n=3); **P<0.01 vs vehicle group.

2.3 EPT对NK细胞杀伤NSCLC细胞的作用的影响如Fig 3A所示，ATP法实验结果表明EPT可以增强NK细胞的杀伤活性。EPT不同浓度作用A549、H1299细胞24 h，效靶比1 ∶1，结果显示随着药物浓度的升高，NK细胞的杀伤作用增加(P<0.05)。如Fig 3B-C所示，以1 ∶1、2 ∶1不同效靶比，可以看出在相同浓度下，效靶比增加，NK细胞杀伤活性增加(P<0.05)。Luciferase法检测结果如Fig 3D-E所示，EPT可以增强NK的杀伤活性。选用0，1和2 μmol·L-1EPT处理A549-luc和H1299-luc细胞(效靶比为1 ∶1、2 ∶1)，同一效靶比下，杀伤能力随药物浓度递增(P<0.01)；相同的浓度下，效靶比越大，杀伤效应越强(P<0.01)，显示出在这两个细胞中，EPT可以明显增强NK细胞的杀伤活性。

Fig 3 Effect of EPT on killing of A549 and H1299 cells by NK cellsA: The special lysis percentage of A549/H1299 cells was incubated with NK cells for 4 h at an effector-to-target ratio of 1 ∶1 after treatment with different EPT concentrations for 24 h n=3);*P<0.05, **P<0.01vs vehicle group.

2.4 EPT对NK细胞脱颗粒的影响流式细胞术检测EPT处理后与A549和H1299细胞共培养的NK细胞的CD107α表达水平，结果如Fig 4所示，使用EPT 0、1和2 μmol·L-1处理肿瘤细胞24 h后，与NK细胞效靶比1 ∶1共孵育4 h，发现在A549、H1299细胞中，随着药物浓度增加，NK细胞脱颗粒水平增加。

Fig 4 Effect of EPT on CD107α degranulation of NK cells A: Detection of CD107α expression in NK cells co-cultured with A549 cells after EPT treatment by flow cytometry (culture time: 24 h). B: Detection of CD107α expression in NK cells co-cultured with H1299 cells after EPT treatment by flow cytometry (culture time: 24 h). C: CD107α+ NK cell percentage in A549 cells n=3); * P<0.05, **P<0.01 vs vehicle group.

2.5 EPT对NSCLC细胞MICA/B表达的影响为考察EPT的免疫增强效应是否与NK细胞对靶细胞的识别有关，流式细胞术检测了EPT对A549、H1299肿瘤细胞表面的NK细胞识别配体MICA/B、HLA-ABC表达的影响，结果如Fig 5所示。实验发现EPT(浓度为1和2 μmol·L-1)可以上调A549和H1299细胞表面MICA/B表达，但没有上调抑制性配体 HLA-ABC表达。EPT可以增强NK细胞对A549、H1299肿瘤细胞的识别。

Fig 5 Effect of EPT on expression of MICA/B in A549 and H1299 cellsA: Detection of MICA/B and HLA-ABC expression in A549 cells after EPT treatment by flow cytometry (culture time: 24 h). B: Relative expression of MICA/B and HLA-ABC in A549 cells after EPT treatment n=3). C: Detection of MICA/B and HLA-ABC expression in H1299 cells after EPT treatment by flow cytometry (culture time: 24 h). D: Relative expression of MICA/B and HLA-ABC in H1299 cells after EPT treatment (x±s, n=3); *P<0.05, **P<0.01 vs vehicle group.

3 讨论

NK细胞为固有免疫系统的重要组成部分，与T、B细胞不同，T、B细胞的激活依赖于抗原致敏、抗体或主要组织相容性复合体(major histocompatibility complex，MHC)的参与，而NK细胞不需要以上步骤的参与便能够直接杀伤靶细胞，因此，NK细胞对比于其他免疫细胞，可以更加快速有效地清除病变细胞，其免疫监视作用更为直接有效[6-7]。自然杀伤细胞2族成员D(natural-killer group 2 member D，NKG2D)为NK细胞表面的重要受体，与配体结合可以激活NK细胞，NKG2D配体包括MHC-I类分子相关蛋白A和B(major histocompatibility complex class I homologues A/B，MICA/B)以及人巨细胞病毒UL16蛋白的结合蛋白(UL16-binding proteins，ULBPs)等[8]。NK细胞与靶细胞接触活化后，可以通过释放穿孔素、颗粒酶、IFN-γ等途径杀伤靶细胞，当靶细胞表面NKG2D配体表达增高，会NK细胞的杀伤活性。而在肿瘤或感染的细胞中DNA损伤持续被激活， NKG2D配体的表达相对于正常细胞增加，当肿瘤细胞DNA被药物等刺激因素进一步损伤后， NKG2D配体的表达升高，能够增加NK细胞对肿瘤细胞的识别杀伤作用[9]。

很多传统化疗和靶向药物可以对肿瘤细胞DNA产生损伤，这一作用可以提高NK细胞的抗肿瘤活性，如舒尼替尼可以增强肝癌HepG2细胞MICA/B、ULBP1/2/3的表达，强化NK细胞的识别与杀伤，这一作用于与舒尼替尼上调NF-κβ2的表达有关[10]。5-fluorouracil(5-FU)也可以强化NK细胞对小鼠结肠癌MC38细胞的杀伤作用，在此过程中，5-FU可以上调NKG2D活化相关的DNAM-1和Rae-1配体的表达，将NK细胞人为耗竭后，5-FU诱导的杀伤作用被明显抑制[11]。部分天然化合物也能够提高NK细胞抗肿瘤活性，沙苑子的黄酮成分(flavonoid component from the seeds of Astragalus complanatus，FAC)可以上调NKG2D、NKp44的表达，强化NK-92细胞对白血病、肝癌细胞的杀伤[12]。

EPT可以诱导多种肿瘤细胞周期阻滞，同时诱导凋亡，其抗肿瘤机制与抑制拓扑异构酶Ⅱ和共价修饰DNA有关[13]，Savorani等[14]报道，EPT可以抑制皮肤T细胞淋巴瘤(cutaneous T-cell lymphoma，CTCL)细胞增殖，诱导凋亡，而抑制EPT诱导DNA氧化损伤的亲脂性抗氧化剂α-生育酚(α-tocopherol)能够逆转EPT的凋亡诱导作用。EPT的抗肿瘤作用与DNA损伤具有重要联系。

在本研究中，EPT对NSCLC细胞具有较强抑制作用，诱导DNA损伤。在EPT本身诱导NSCLC细胞DNA损伤的同时，肿瘤细胞表面MICA/B的表达被上调，从而增加了肿瘤细胞对NK细胞的敏感性，增强了NK细胞识别杀伤肿瘤细胞的能力，在自身具备抑制作用的前提下，还强化了周边NK细胞对NSCLC细胞的识别与杀伤。这是一种强化固有免疫中NK细胞监视功能从而杀伤肿瘤细胞的特殊作用。但是，目前肿瘤细胞的DNA损伤与肿瘤细胞表面MICA/B的表达的直接关系尚缺乏报道，DNA损伤导致的细胞表面抗原的变化具体机制目前仍待进一步探索。

EPT具备转化为抗NSCLC药物的潜力，而更进一步的药效学与药物代谢动力学及毒理学研究将加速这一进程。天然化合物很多具备高效低毒的特点，进一步深化抗肿瘤免疫的研究将有助于其成为新兴的抗肿瘤药物群体。