卡马西平对正常大鼠精子质量及StAR蛋白表达影响

刘宇轩,刘红娟，吴德玲，童小慧，李 莉，王桐生,3

(安徽中医药大学 1.中西医结合学院药理学教研室，2.科技处，3.中西医结合研究所，安徽 合肥 230012)

卡马西平(carbamazepine，CBZ)是经典的抗癫痫药，为治疗单纯或复杂部分性发作癫痫的首选药[1]。临床使用卡马西平多长期用药，对其毒副作用研究大部分局限于肝肾功能损伤等，而对男性生殖系统安全性并未进行充分审查[2]。近年研究发现卡马西平可导致激素水平紊乱、精子质量下降[3]，甚至出现性功能障碍[4-5]，但雄性生殖系统损伤的具体机制研究较少，并存在一定争议[6]。本研究通过对大鼠长期给予不同剂量卡马西平，观察其对精子质量、睾丸结构、睾酮水平的影响，分析卡马西平的生殖毒性及部分机制，为临床安全用药提供参考。

1 材料与方法

1.1 实验动物♂ Sprague-Dawley(SD)大鼠，适龄6～8周，体质量(200～220) g，SPF级，购于济南朋悦实验动物繁育有限公司，许可证号SCXK(鲁)20190003。昼夜12 h交替照明环境下饲养，控制温度(20～25) ℃，相对湿度(60±5)%。

1.2 药物与试剂卡马西平片(江苏鹏鹞药业有限公司，批号1901101)；大鼠T、LH、FSH、E2、PRL、P酶联免疫吸附测定ELISA检测试剂盒(泉州市睿信生物有限公司，批号均为08/2019)；4%多聚甲醛固定液；BCA蛋白定量试剂盒(上海碧云天生物技术公司，批号102517180413)；BSA(美国Solarbio公司，批号A1810)；StAR抗体(英国Abcam公司，批号ab12556)，3β-HSD抗体(北京博奥森生物技术有限公司，批号ABP50859)，17β-HSD抗体(美国Proteintech公司，批号OC181821)，GAPDH内参抗体(英国Abcam公司，批号ab18365)。

1.3 仪器精子计数板(Makler Counting Chamber，以色列)；生物组织包埋机(湖北泰维电子有限公司)；NOVA超薄切片机(LKB公司)；Ⅸ81型光学显微镜(日本Olympus公司)；DYY-6C型电泳仪(北京六一生物科技有限公司)；MK3型酶标仪(美国Thermo公司)。

1.4 方法

1.4.1动物分组与处理 将大鼠随机分为卡马西平50、100、200、400 mg·kg-1剂量组(按公斤体重计算，相当于人用量600 mg·d-1的5、10、20、40倍)和空白对照组，各组动物按剂量灌胃给药，10 mL·kg-1，空白组给予同等量的蒸馏水，连续给药90 d。末次给药后禁食不禁水12 h，3%水合氯醛麻醉大鼠，腹主动脉采血，摘取睾丸、附睾等脏器，进行相关指标检测。

1.4.2脏器系数测定 取大鼠睾丸、附睾称重，计算脏器系数。脏器系数/%=脏器重量(g)/体重(g)×100%。

1.4.3精子计数、精子活率及活力测定 将附睾洗净，剥离脂肪组织，放入盛有3 mL，37 ℃预热生理盐水的烧杯内，用眼科剪沿附睾尾端横纵切6～8刀，置于37 ℃水浴培养箱中分散15 min，让精子从附睾尾中游离出，200目滤网过滤得精子悬液，保持温度37 ℃。蘸取一滴精子悬液置于Marker精子计数板中央的计数池中，200倍光学显微镜观察10×10方格内精子数(n)，每毫升精子数为n×106。每只大鼠观察200个精子，并进行精子质量评级。分级标准如下：(a) 快速直线向前运动，直线运动；(b)缓慢向前直线运动或呆滞向前移动，缓慢运动；(c)非向前运动或原地颤动，原地运动；(d)不能活动，不运动。计算精子活率，活率/% =(a+b+c)/(a+b+c+d)×100%；统计向前移动的精子数，计算精子活力，活力/%=(a+b)/(a+b+c+d)×100%。

1.4.4ELISA法测定血清及睾丸组织性激素含量 腹主动脉采血，4 ℃离心机3 000 r·min-1离心15 min，分离血清；取睾丸组织200 mg加入2 mL生理盐水研磨至匀浆，4 000 r·min-1离心10 min，取上清液-20 ℃保存。经酶联免疫吸附法(ELISA)测定血清及睾丸组织T、LH、FSH、E2、PRL、P水平。

1.4.5HE染色观察大鼠睾丸组织形态学变化 取新鲜睾丸组织4%多聚甲醛固定24 h以上，进行常规组织脱水、包埋、切片，HE染色，400倍光镜下观察并拍照。

1.4.6Western blot检测睾丸组织中StAR、3β-HSD及17β-HSD蛋白表达 取200 mg睾丸组织加入2 mL的RIPA裂解液(1 mmoL·L-1PMSF)研磨，3 000 r·min-1离心后提取组织总蛋白，BCA蛋白浓度试剂盒检测蛋白含量。样本加入2倍蛋白上样缓冲液，水浴煮沸6 min使蛋白变性，以GAPDH作为内参测定StAR、3β-HSD和17β-HSD蛋白表达。上样蛋白于SDS-PAGE电泳分离(10%浓缩胶电泳80 V、40 min，4%分离胶电泳120 V、1.5 h)，转移至PVDF膜上，5%BSA室温封闭1.5 h，洗膜后与一抗(1 ∶1 000) 4 ℃孵育过夜，再次洗膜后与辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG (1 ∶10 000)摇床孵育1.5 h，避光条件下滴加ECL化学发光试剂于成像系统检测条带信号。采用ImageJ软件分析各条带的灰度值，计算相对蛋白表达量，相对蛋白表达量/%=目的蛋白灰度值/内参蛋白灰度值×100%。

2 结果

2.1 卡马西平对正常大鼠脏器系数的影响Fig 1结果显示，与空白对照组比较，连续灌胃90 d后，卡马西平各组睾丸重量及睾丸脏器系数减小，差异具有统计学意义(P<0.05)；体重、附睾重量以及附睾脏器系数差异无统计学意义(P>0.05)。

Fig 1 Effect of carbamazepine on testicular and epididymal coefficient in n=8)*P<0.05，**P<0.01 vs control group.

2.2 卡马西平对正常大鼠精子计数、精子活率及活力的影响Tab 1结果可见，与空白对照组比较，卡马西平各组精子活率、活力均明显降低，差异均具有统计学意义(P<0.05)，其中以400 mg·kg-1组精子活率及活力降低最为明显，但精子计数差异无统计学意义(P>0.05)。

Tab 1 Effect of carbamazepine on sperm count and sperm viability and sperm motility in

2.3 卡马西平对大鼠血清及睾丸组织性激素水平的影响血清性激素六项水平结果显示，与空白对照组相比，卡马西平各组T水平明显降低，且随药物浓度升高呈梯度性下降，LH、FSH水平明显升高，差异有统计学意义(P<0.05)。见Tab 2。

Tab 2 Effect of carbamazepine on serum hormone levels in n=8)

睾丸组织性激素六项水平结果显示,与空白对照组相比，卡马西平各组T、P水平明显降低，且随药物浓度升高呈梯度性下降，LH、FSH水平明显升高，差异具有统计学意义(P<0.05)。见Tab 3。

Tab 3 Effect of carbamazepine on level of sex hormone in rat n=8)

2.4 卡马西平对大鼠睾丸组织形态的影响对睾丸组织HE染色、光镜检查，结果显示空白对照组睾丸组织结构清楚，生精小管上皮层次完整、排列密集，管内可见清晰的各级生精细胞(精原细胞、精母细胞及精子细胞)和支持细胞，管间的间质细胞形态数目正常。给药各组出现睾丸结构不完整，生精小管上皮退化、排列松散紊乱，各级生精细胞数量减少，管腔内精母细胞分化为精子细胞阶段出现停滞，在200、400 mg·kg-1剂量组中小管间质减少、松散程度加重，间质细胞数目减少。见Fig 2。

Fig 2 Effect of carbamazepine on testicular morphology in rats(HE×400)A：Control group；B：50 mg·kg-1 CBZ group；C：100 mg·kg-1 CBZ group；D：200 mg·kg-1 CBZ group；E： 400 mg·kg-1 CBZ group

2.5 卡马西平对StAR，3β-HSD，17β-HSD蛋白表达的影响采用Western blot检测睾酮合成关键酶蛋白的表达水平。结果显示：与空白对照组相比，给药各组StAR、3β-HSD和17β-HSD蛋白表达均出现不同程度的下降，其中给药各组StAR表达随着药物浓度增加而明显降低(P<0.05)，100、200和400 mg·kg-1剂量组3β-HSD表达明显降低(P<0.05)，200和400 mg·kg-1剂量组17β-HSD表达明显降低(P<0.05)。见Fig 3。

Fig 3 Effects of carbamazepine on expression of StAR, 3β-HSD and 17β-HSD key enzymes in testicular tissues*P<0.05，**P<0.01 vs control group.

3 讨论

卡马西平作为单纯或复杂部分性癫痫发作首选药，长期用药会对雄性生殖系统产生明显的毒性作用，可导致正常大鼠生殖系统出现阶梯性损伤，其影响程度与药物浓度呈正相关[7]。本研究结果显示，正常大鼠长期灌胃卡马西平后，睾丸重量减小，脏器系数减小，精子活率和活力均下降，睾丸正常生理结构发生改变，生精小管以及各级生精细胞出现不同程度的病变，损伤程度随着给药浓度的增高而加重，与文献报道基本一致，说明卡马西平严重影响雄性大鼠生殖系统各项指标，损伤睾丸生殖细胞结构与功能，且存在药物浓度相关性。

睾酮是男性体内最主要的雄性激素，缺乏睾酮会导致精子质量下降、男性性欲低下，甚至勃起功能障碍[8]。睾酮由睾丸间质细胞产生，占总体水平的95%，是体内睾酮的主要来源[9]。间质细胞在合成睾酮时需进行一系列酶促反应[10]，胆固醇在转运蛋白的调控下从线粒体外膜转运至线粒体内膜，其中StAR起到关键性作用，为睾酮合成的主要限速步骤[11-12]。胆固醇进入线粒体内膜后一方面在3β-HSD催化下转化为孕酮，另一方面被P45017α催化为17-羟孕酮和雄烯二酮，最后雄烯二酮在17β-HSD作用下转化为睾酮[13]，研究表明间质细胞损伤会影响睾丸类固醇生成[14]。Svalheim研究发现，以卡马西平为代表的抗癫痫类药物单药治疗引起男性血清睾酮水平下降[15]，本研究结果显示，与正常组相比，卡马西平给药各组大鼠的血清以及睾丸组织T均明显降低，Western blot检测给药各组StAR、3β-HSD，17β-HSD表达减少。说明卡马西平可能通过下调睾酮合成路径相关酶蛋白的表达，导致大鼠体内的睾酮水平下降。

下丘脑-垂体-睾丸轴(hypothalamus-pituitary-testis axis，HPT轴)是调节男性生殖系统功能的主要神经内分泌调节系统，以自分泌或旁分泌的形式进行调控，下丘脑的正中前视核脉冲性释放促性腺激素释放激素，通过垂体门脉系统作用于腺垂体释放 LH和FSH等促性腺激素，从而促进性腺发育成熟和性激素的合成[16]。当自身发生病变或外源性化学物质干扰了雄激素正常水平，会对HPT轴产生应激作用，通过负反馈机制改变LH以及FSH等促性腺激素的分泌量[17-18]。本实验结果显示， 血清及睾丸组织中LH、FSH明显升高，可能与卡马西平降低大鼠T水平，从而使HPT轴应激产生负反馈调节有关。