金纳米颗粒介导阿托伐他汀载体的构建及其对心肌再灌注损伤影响的研究

朱 琳,李 屹,张 蛟,俞 泓,张晓静,刘惠亮

(1.安徽医科大学解放军总医院第三医学中心临床学院心脏病研究所，北京 100039；2.解放军总医院第三医学中心心内科,北京 100039；3国家电网公司北京电力医院心内科，北京 100073)

他汀类药物，是临床常用的降胆固醇类药物。多项基础研究表明他汀类药物具有非降胆固醇作用外的多效心肌保护功能，如：抗炎、抗氧化、抗凋亡等[1-3]。临床研究证实，长期口服他汀类药物可以有效减少心梗面积、改善心肌再灌注损伤(myocardial ischemia reperfusion injury，MIRI)损伤后的心功能[4-5]。但尚有临床研究指出，经皮动脉介入治疗(percutaneous coronary intervention,PCI)术前给予患者连续1周服用他汀类药物却无明显抗MIRI的保护作用，他汀类对心肌的保护作用与服用的时间成明显的正相关[6,7]，推测可能因他汀缺乏组织特异性识别及易于在体内代谢所致。对于急性心梗需紧急行血液再灌注的患者，如何能够通过短时给予他汀类药物，使药物在体内持续缓释以长时间在心肌部位达到他汀类的有效作用浓度，成为突破他汀类药物在临床抗MIRI应用限制的关键点。药物递送系统可为解决他汀类药物在临床治疗MIRI的应用限制提供了有效的策略。阿托伐他汀(Atorvastatin, Ator)作为强效降脂药，具有强抗氧化性、较长的半衰期、安全性好等特点使其在临床应用受到广泛关注。因此，采用Ator作为本研究的目标药物。

新型纳米材料-金纳米颗粒(gold nanoparticle，AuNPs)是易于合成的小型稳定金属胶体粒子(尺寸范围为1～100 nm)，因其官能化较为简单，具有良好的生物相容性及亲和性，是潜在的心肌细胞基因/药物载体[8]。此外，由于金纳米颗粒的特殊结构或基团使其可模拟超氧化物歧化酶、过氧化氢酶等多种酶的生物学活性。已有研究将金纳米颗粒单独应用于糖尿病、肝损伤等疾病的抗氧化应激的治疗研究中[9]。因此，金纳米颗粒不仅可作为治疗心肌缺血/再灌注损伤的药物载体以达到他汀类药物缓释的作用，其抗氧化性能更能与他汀药物协同，以增强单一他汀类药物抗MIRI作用。

综上，本研究旨在通过观察“AuNPs-Ator”药物转运载体对体外心肌细胞氧糖剥夺再灌注损伤后的保护作用，为AuNPs进一步应用于心肌疾病中药物/基因递送及协同他汀类药物以高效发挥抗MIRI保护作用提供有价值的理论依据。

1 材料与方法

1.1 主要材料与试剂

1.1.1实验动物 SD大鼠24 h内乳鼠若干只，雌雄不限，北京维通利华有限公司提供，使用合格证号：SCXK(京)2016-0006。

1.1.2试剂 DMSO(美国Sigma公司，No 1129E0311)；柠檬酸三钠(西陇化工股份有限公司,GB/T 16493-1996)；SH-PEG-NH2(MW 2000，北京华力德有限公司,RO0192305)；阿托伐他汀(上海麦克林有限公司,C10326766)；CCK-8试剂盒(上海碧云天生物技术公司，No 090619200102)；DMEM(8119416)、0.05%胰蛋白酶(2003820)、0.25%胰蛋白酶(美国Gibco公司，2053591)；BCA染色试剂盒(中国碧云天生物技术有限公司，No 071019190910)；抗荧光衰减封片剂(北京索莱宝有限公司，No S2110)。

1.1.3仪器 纳米粒度及Zeta电位分析仪(英国马尔文公司)；超净台(BCV-1360，中国)；细胞孵箱(日本松下公司)；酶标仪(美国Versa公司)；动物手术器械(上海手术器械厂)；紫外可见分光光度计(美国lambda公司)。

1.2 金纳米颗粒的制备采用柠檬酸盐还原法合成AuNPs。取100 mL浓度为0.25 mmol·L-1HAuCl4水溶液加热，溶液沸腾后加入4.5 mL质量分数为1%的柠檬酸钠水溶液，继续保持沸腾状态15 min。此时，溶液可呈深红色。室温下冷却后备用。

1.3 药物复合载体的制备及表征

1.3.1药物复合载体的制备 PEG与AuNPs按W/W为3 ∶1修饰金颗粒表面，室温条件下避光搅拌6 h。15 000 r·min-1离心15 min、弃上清重悬，这一过程重复多次以弃去未结合的PEG，即可得到功能化的AuNPs(F-AuNPs)，室温下留置备用。取2 mg的Ator溶于3 mL含有质量分数为1% DMSO的功能化金颗粒溶液中，室温条件下搅拌24 h，15 000 r·min-1离心15 min取上清重悬，小心吸取上清备用。重悬液冷冻干燥后称重。

1.3.2DLS测量粒径及电势 取1 mL AuNPs、F-AuNPs、AuNPs-Ator三种溶液，加入纯水稀释至4 mL。分别取3 mL、1 mL上述溶液置于粒径与电势测量的样品池中，每种溶液运行3次。

1.3.3UV-Vis测量阿托伐他汀的搭载量 精密称取25 mg的Ator于25 mL的容量瓶中，用含有质量分数为1% DMSO溶液的蒸馏水溶解并定容至刻度，超声5 min，充分溶解。将Ator母液分别用纯水稀释至不同浓度的标准液，过滤，UV-Vis测定在238 nm处测定不同浓度标准液的吸光度。得到以吸光度(A)为纵坐标，浓度(C)为横坐标的标准曲线。将Ator与F-AuNPs反应后离心得到的待测液过滤，测定吸光度，带入标准曲线公式算出未加载的Ator浓度。并根据公式(1)计算出Ator的负载量。

负载量/%=(阿托伐他汀的总投入量-上层清液阿托伐他汀的含量)/载阿托伐他汀的纳米复合物的总质量×100%

(1)

1.3.4UV-Vis测定药物复合载体的释放速率 称取一定质量的Ator溶解于含有质量分数为1% DMSO的F-AuNPs溶液中，室温条件下反应24 h。反应后的溶液，离心去上清，重悬，这一过程重复2～3次，以充分弃去溶液中未结合的Ator。重悬后的溶液静置室温条件下，分别在不同时间段取500 μL溶液于离心管中离心取上清，纯水重悬后再次加入原溶液中。取出的上清液，用纯水稀释至3 mL，采用UV-Vis在238 nm处测出最大吸光度值，所得结果带入阿托伐他汀的标准曲线中得出待测液浓度。

1.3.5原代心室肌细胞的分离培养与鉴定 参考文献中方法提取新生乳鼠的心室肌细胞(neunatal rat ventricular mycytes,NRVMs)，隔天换液[10]。原代的心室肌细胞鉴定应用心肌特异肌钙蛋白T(cTNT)细胞免疫荧光染色。

1.3.6CCK-8评估药物复合载体的细胞毒性 将NRVMs培养于96孔板中(1×105个细胞/孔)，每个实验浓度组(0、0.05、0.1、0.15、0.2 mmol·L-1)设置5个复孔。分别培养1 d、3 d。PBS轻柔冲洗细胞2～3遍，按说明书进行CCK-8的配置与操作。酶标仪检测细胞于450 nm处的吸光度。根据公式(2)计算得出细胞的存活率。

细胞存活率/%=[A(加药)-A(空)]/[A(0)-A(空)]×100%

(2)

1.4 原代心肌细胞OGD/R模型的建立与抗MIRI的检测

1.4.1氧糖剥夺再灌注模型(Oxygen glucose deprivation/ reperfusion，OGD/R)的建立 经不同条件处理的NRVMs，置于37 ℃、5% CO2条件下孵育24 h后，将原高糖培养基更换为含有质量分数为15% FBS无糖的培养基，细胞在充满95% N2和5% CO2的孵箱中继续孵育24 h，孵育后的细胞重新换成新鲜的原培养基成分，在充满5% CO2和95%空气再孵育3 h，以建立OGD/R模型。

1.4.2DHE染色评估药物复合载体的抗氧化性 将NRVMs以6×105个/孔的细胞密度接种在24孔板，随机分为空白对照组、OGD/R组、AuNPs预处理组、Ator预处理组、AuNPs-Ator预处理组。将含15%血清的DMEM稀释好的终浓度为0.05 mmol·L-1AuNPs、AuNPs-Ator及4 μmmol·L-1Ator加入相应的实验组中孵育24 h，除空白对照组正常培养外，其他组均建立OGD/R模型。按说明书操作进行细胞DHE染色。激光共聚焦显微镜下观察不同视野。

1.4.3RNA提取及qRT-PCR检测 心肌细胞分组及处理方法同上。使用TRIzol试剂盒提取各处理组RNA。采用Bulge-LoopTMmiRNA qRT-PCR Starter Kit检测试剂盒进行qRT-PCR，反应在7500 Real-Time PCR System上进行。用于实时PCR的引物如下：rno-miR-199a-5p和U6内参。使用2-ΔΔCt方法计算各处理组中目标基因miRNA-199a-5p的表达水平。

1.4.4Western blot检测 心肌细胞分组及处理方法同上。提取处理后各组的细胞蛋白，配置15% SDS-PAGE凝胶，浓缩胶，在冰浴下进行电转使蛋白尽快转移至PVDF膜上。将PVDF膜置于5%配置好的脱脂奶粉中室温条件下封闭1 h，根据所显示的marker条带分离相应的目的条带。获取的条带置于预先配置好的一抗稀释液(caspase-3、GSK-3β)中过夜，充分洗涤后室温条件下继续二抗孵育1 h，超敏发光液显影蛋白。最终采用ImageJ分析目标条带及内参条带的灰度值。

2 结果

2.1 药物复合载体的表征

2.1.1粒径及电势 Fig 1所示，AuNPs在水溶液中分散测得的纳米粒径集中在5～15 nm左右的范围，电势为-11 mV(Fig 1A、D)。经PEG修饰后，粒径集中在10～25 nm，电势为4 mV(Fig 1B、D)。静电吸附上Ator后，药物复合载体的粒径分布在20～55 nm的区间内，电势则为-7 mV(Fig 1C、D)。根据药物搭载前后的纳米粒径及电势的变化，可以确定“AuNPs-Ator”药物复合材料已成功构建。

Fig 1 Particle size and electric potential distribution curve of drug complex A:Particle size distribution of AuNPs; B:Particle size distribution of F-AuNPs;C:Particle size distribution of “AuNPs-Ator”; D:Electric potential of different materials.

Fig 2 Schematic illustration of Ator connect to F-AuNPs

2.1.2药物复合载体的搭载量 利用UV-Vis测得Ator的紫外吸收峰(Fig 3A)，根据配制标准溶液在不同浓度下的最大吸收峰，绘制出吸光度与浓度之间的标准线。以浓度(C,g·L-1)为横坐标，吸光度(A)为纵坐标，建立两者之间的回归方程为Y=37.82X+0.118，R2=0.994 78(Fig 3B)。根据标准曲线和公式(1)可间接计算出，Ator的搭载量为60%。

Fig 3 UV absorption peak of atorvastatin (A)and its standard curve of concentration against

2.1.3阿托伐他汀的释放速率 “AuNPs-Ator”药物复合载体在室温静置条件下于不同时间点收集上清，测定其紫外吸光度值，根据标准曲线得到不同时间点的上清液中的药物浓度，计算与所搭载药物总量的比值得到累积释放率，曲线拟合得到药物释放曲线(Fig 4)。结果显示药物复合载体48 h的累积释放率达到88.36%，10 h药物即可达到稳定释放状态。

Fig 4 Drug-releasing profile

2.1.4药物复合载体的细胞相容性 CCK-8试剂因与活细胞内的脱氢酶发生反应，经CCK-8孵育细胞的活性与其在450 nm处检测得到的吸光度值成正比。细胞存活率与吸光度之间的关系按公式(2)计算，统计结果如Fig 5所示。1、3 d培养后的药物复合载体浓度在0.05 mmol·L-1组的细胞存活率与正常未加药空白组相比，差异无统计学意义(P>0.05)。但0.10、0.15、0.20 mmol·L-1这3组浓度与空白组相比，均明显影响细胞的活性(P<0.05)。表明药物复合载体的浓度为0.05 mmol·L-1时，对细胞具有良好的相容性。

Fig 5 Viability of NRVMs treated with different concentrations of drug complex carrier after one day or three A:viability of NRVMs at 24 h time pretreated by drug complex carrier; B: viability of NRVMs at 72 h time pretreated by drug complex carrier. *P<0.05,**P<0.01 vs 0 mmol·L-1.

2.2 体外NRVMs模型中的药物复合载体抗氧糖剥夺再灌注损伤

2.2.1各组心室肌细胞氧糖剥夺后的ROS水平比较 DHE染色后红色荧光的强度与细胞内ROS的水平与呈正相关。实验结果显示(Fig 6)，相对于正常空白组，OGD/R模型建立后的心肌细胞内ROS水平明显增加(P<0.01)。0.05 mmol·L-1浓度的AuNPs组、4 μmmol·L-1的Ator处理组，细胞内ROS含量均明显低于OGD/R组细胞(P<0.01)。而加入“AuNPs-Ator”药物复合载体处理的NRVMs，其胞内ROS水平不仅明显低于OGD/R组(P<0.01)，而且亦明显低于两组单独材料孵育组(P<0.01)。因此，我们可以说明AuNPs不仅可以适用于Ator的药物搭载载体，也可以发挥与Ator协同抗氧化的作用。

Fig 6 ROS levels in NRVMs of different groups detected by DHE staining(scale bar: 50 μm)**P<0.01 vs Blank;##P<0.01 vs OGD/R; △△P<0.01 vs Ator

2.2.2各组miRNA-199a-5p基因表达的水平 miR-199a-5p是对缺氧敏感的miRNA，研究指出其表达上调通过miR-199a-5p/GSK-3β机制途径参与MIRI后心肌梗死与肥大的进展[11]。如Fig 7所示，OGD/R组与正常空白组相比miR-199a-5p表达水平明显升高(P<0.01)，AuNPs处理组的目的基因表达水平相较于OGD/R组而言无明显变化(P>0.05)，阿托伐他汀可明显降低OGD/R处理后心肌细胞中miR-199a-5p的表达水平(P<0.05)，而“AuNPs-Ator”易被细胞吞噬的特点及较高Ator搭载量，使得其降低目标基因的表达水平要优于单独Ator的应用(P<0.01)。

Fig 7 miR-199a-5p expression level of different *P<0.05 vs OGD/R;##P<0.01 vs Ator

2.2.3各组蛋白量的表达 各处理组中蛋白表达结果如Fig 8所示，与空白组相比OGD/R可诱导miR-199a-5p表达上调以抑制GSK-3β这一心肌保护蛋白的表达，促进心肌细胞的凋亡。Ator与“AuNPs-Ator”均可通过明显抑制miR-199a-5p表达以上调GSK-3β蛋白(P<0.01)，而药物复合载体组的保护作用优于单独他汀治疗组(P<0.01)。“AuNPs-Ator”、AuNPs及Ator均可以明显抑制心肌细胞凋亡(P<0.01)，且“AuNPs-Ator”的心肌保护作用均优于单独的材料处理组(P<0.01)。

Fig 8 Expression of capase-3 protein and GSK-3β protein measured by Western A:The expression of GSK-3β protein,**P<0.01 vs Blank;#P<0.05,##P<0.01 vs OGD/R ;B:The expression of capase-3 protein,**P<0.01 vs OGD/R；##P<0.01 vs Ator.

3 讨论

缺血性心肌病是我国居民致死的主要原因之一，虽然随着药物溶栓、经皮冠状动脉腔内血管成形术、冠状动脉旁路移植术等治疗方法的临床应用，缺血心肌可得到及时而有效的再灌注治疗，明显降低了缺血性心脏病的死亡率。但与此同时，MIRI也引起了我们极大的关注，可以说MIRI已成为缺血心肌从冠脉再灌注治疗中获得最佳疗效的主要障碍。本研究构建了原代心肌细胞的氧糖剥夺再灌注模型，研究结果表明OGD/R处理组的细胞内ROS含量、miR-199a-5p基因及凋亡蛋白表达水平均明显高于空白组，体外的OGD/R可很好地模拟在体的心肌缺血/再灌注损伤。

他汀类药物的多效心肌保护作用得到广泛的基础研究证实，但在临床研究中他汀类抗MIRI的有效性却未得到统一结论。如上文所述，他汀类药物早期启动与更好的临床抗MIRI疗效呈明显正相关,他汀类药物在冠脉开通前的短期急性给药的心肌保护效用明显降低[12]。因此，急需一种新的给药策略以突破这种限制。金纳米颗粒作为被广泛研究应用的纳米材料，其临床应用的安全性被大量证实。且PEG修饰后的AuNPs可降低单核巨噬细胞系统对其吞噬作用，延长药物在体内清除时间，有望增加心肌局部的他汀类药物浓度。基于此，本研究构建“AuNPs-Ator”这一复合载体并进行理化表征。结果表明，该药物复合载体在0.05 mmol·L-1处对细胞具有良好的相容性，且具有较高Ator的搭载量及缓释效果。

大量研究表明，氧化应激是MIRI发生发展的关键因素之一，可在冠脉开通时的前几分钟内在多种途径的作用下大量产生。再灌注损伤发生过程中也存在持续引起ROS增加的正反馈作用途径，这一作用途径主要依赖于ROS刺激下胞膜L型钙离子通道的活化作用。MIRI发展过程中在高ROS水平作用下，导致LTCC被谷胱甘肽化，离子通道活性增加，细胞内Ca2+水平升高促进线粒体ROS产生。而ROS的增加则继续使LTCC保持活跃状态。ROS“滚雪球效应”加重了血管开通后的心肌损伤，诱导了再灌注后心肌细胞的凋亡、坏死，促进了心肌细胞肥大与重构的进展[13]。因此，通过研究抗氧化应激对MIRI所产生的有利影响，将为预防和控制MIRI的不良预后提供有价值的治疗策略。DHE染色结果表明，“AuNPs-Ator”药物复合载体中AuNPs与Ator可具有协同抗氧化作用。

细胞凋亡是目前公认的MIRI发生发展过程中另一重要的病理生理机制，预防和治疗心肌细胞凋亡是减缓MIRI后心室重构研究的重要领域。微小RNA(miRNA)是小的(<22个核苷酸)非编码RNA，miRNA作为mRNA翻译的内源性细胞内调节剂，可通过调节多种基因表达在心血管疾病进展中发挥着重要作用。Zuo等[11]率先提出Ator可能通过抑制miR-199a-5p基因表达以上调心肌保护蛋白GSK-3β的水平来降低MIRI后心肌的凋亡，这一特定的途径揭示了他汀类药物心肌保护效用的部分潜在作用机制。本研究中通过qRT-PCR及Western blot再次证实了Ator对miR-199a-5p/GSK-3β这一通路的调节作用，同时由于AuNPs易被细胞吞噬的特性，使得药物复合载体相较于Ator更易进入细胞以调节目的基因的表达。

综上所述，“AuNPs-Ator” 药物复合载体不仅具有Ator药物高搭载量及缓释效果，其更可协同AuNPs与Ator的抗氧化性，增强对目的基因的调节作用，从而更好地发挥他汀类药物的心肌保护效应。