超高效液相色谱-串联质谱法测定运动型乳饮品中的氨基酸

尤佳丽

（1.河南科技大学应用工程学院，河南三门峡472000；2.三门峡职业技术学院，河南三门峡472000）

0 引 言

运动型乳饮品是指添加一种或多种氨基酸，一定程度上可以调节人体功能的饮品。因其添加的氨基酸能被人体直接吸收，其效果比补充蛋白质类的营养品效果快，比较受消费者的喜爱[1-3]。但是此类饮品的市场庞大，种类繁多[4-6]，有必要分析其中氨基酸的种类以及含量，以便保障人们科学、定量地摄入氨基酸。

常见的氨基酸分析方法有气相色谱法、高效液相色谱法、毛细管电泳法、离子色谱法等[7-16]。本研究依据质谱仪器的特点，运用HLB小柱简化提取过程，建立固相萃取-超高效液相色谱-串联质谱法同时测定运动型乳饮品中Gly，Ala，Ser，Pro，Val，Thr，Ile，Leu，Asp，Lys，Glu，Met，His，Phe，Arg，Tyr等16种氨基酸，可为运动型乳饮品中多种氨基酸同时检测提供技术支持和参考。

1 实 验

1.1 仪器与试剂

超高效液相色谱仪（AB6010），四极杆串联质谱仪（AI2000）。

标准品Gly，Ala，Ser，Pro，Val，Thr，Ile，Leu，Asp，Lys，Glu，Met，His，Phe，Arg，Tyr。

1.2 样品来源

实验所用的运动型乳饮品均是随机购于市场上。

1.3 超液相色谱条件

色谱柱为Acclaim Explosive E2(2.1mm×150mm，3μm)；流动相A为质量分数0.10%甲酸溶液，B为甲醇；流动相梯度洗脱程序如表1所示。

1.4 方法

1.4.1 质谱条件的优化

对质谱的各个参数的选择，选用ESI+模式，采用分别进样的方式，对Gly，Ala，Ser，Pro，Val，Thr，Ile，Leu，Asp，Lys，Glu，Met，His，Phe，Arg，Tyr等16种氨基酸的每个物质的定性离子和定量离子进行确定。

表1 流动相梯度洗脱程序

1.4.2 标准曲线的制作

以浓度为0.1 mol/L的盐酸溶解Gly，Ala，Ser，Pro，Val，Thr，Ile，Leu，Asp，Lys，Glu，Met，His，Phe，Arg，Tyr等16种氨基酸标准品，并定容到10 mL，得到氨基酸混合标准储备液，浓度均为100μmol/L。以此为储备液，配制一系列的混合标准溶液，上机检测，绘制标准曲线。

1.4.3 样品前处理方式的优化

由于运动型乳饮品中的基质主要含有蛋白质以糖类等基质[17-20]，本研究比较了两种前处理方式对样品检测的影响，并对固相萃取条件进行优化。

1.4.4 加标回收实验及样品测定

在运动型乳饮品中加入Gly，Ala，Ser，Pro，Val，Thr，Ile，Leu，Asp，Lys，Glu，Met，His，Phe，Arg，Tyr等16种氨基酸的标准混合溶液，计算回收率；并选择5种常见的运动型乳饮品，选择优化后的前处理条件和仪器条件，对其中的氨基酸含量及种类进行测定。

2 结果与讨论

2.1 色谱条件的选择

本研究在参考其他文献的基础上[21-26]，选用采用Acclaim Explosive E2色谱柱来分离16种氨基酸，效果比较理想，色谱峰的峰形较好。此外，本实验流动相选择甲醇-0.10%甲酸铵溶液时，色谱峰形较好，质谱响应较高，结果如图1所示。

图1 16种氨基酸混合标准溶液的色谱

2.2 质谱条件的优化

分别对浓度为100μmol/L的Gly，Ala，Ser，Pro，Val，Thr，Ile，Leu，Asp，Lys，Glu，Met，His，Phe，Arg，Tyr的标准溶液质谱参数的优化，如表2所示。

依照表2所设定质谱的条件，16种氨基酸的MRM图如图2所示。

表2 16种氨基酸的多反应监测扫描模式的质谱参数

图2 16种氨基酸的MRM

表3 16种氨基酸的保留时间、标准曲线、相关系数、检出限与定量限

2.3 标准曲线的制作

对Gly，Ala，Ser，Pro，Val，Thr，Ile，Leu，Asp，Lys，Glu，Met，His，Phe，Arg，Tyr等16种氨基酸的线性方程的绘制，如表3所示。由表3可以看出，16种氨基酸在浓度为0.10～10.00μmol/L范围内线性关系良好，R2为0.9924～0.9993，检出限范围为0.005～0.05μmol/L，定量限范围为0.03～0.20μmol/L。

2.4 前处理方式的优化

在对运动型乳饮品中的Gly，Ala，Ser，Pro，Val，Thr，Ile，Leu，Asp，Lys，Glu，Met，His，Phe，Arg，Tyr不同提取方式对目标物的提取有很大影响，以标称含有多种氨基酸的运动型乳饮品为实验对象，比较了两种不同的方式。方式Ⅰ：样品以10%乙醇作为提取剂，提取后离心，上清液上机检测；方式Ⅱ：样品经SPE小柱净化，再经过淋洗和洗脱后上机检测，实验结果如图3所示。

由图3可以看出，经固相萃取小柱Oasis PRiME HLB处理过的样品液中干扰物明显减少。这是由于SPE小柱中的材料对运动型乳饮品中杂质有吸附作用，能将样品中目标物有效的通过，而截留样品中的杂质，对实验的准确性和精确性有很大的提高；而以体积分数为10%乙醇沉淀运动型乳饮品的蛋白质，很难将样品中的干扰物清除完全。因此，本方法选择Oasis PRiME HLB处理过为适宜的前处理方式。

2.5 固相萃取小柱萃取条件的优化

2.5.1 洗脱液的选择

依据上述试验结果选用Oasis PRiME HLB固相萃取小柱对运动型乳饮品中16种氨基酸进行净化和富集，在对小柱的洗脱液方面分别比较了超纯水、25%，50%，75%，100%的甲醇溶液（体积分数）等5种溶液的洗脱效果，结果以16种氨基酸的平均回收率为比较依据，结果如图4所示。

图3 两种处理方式的色谱图比较

图4 洗脱液对16种氨基酸平均回收率的影响

由图4可以看出，当甲醇体积分数为25%时，16种氨基酸平均回收率比较高，此时体积分数为25%甲醇的溶液洗脱能力较强，能较完全地洗脱目标物，所以本研究选择体积分数为25%的甲醇溶液作为样品的洗脱液。

2.5.2 洗脱液体积的选择

在上述选用体积分数为25%甲醇作为Oasis PRiME HLB固相萃取小柱洗脱液的基础上，比较了洗脱液体积对16种氨基酸平均回收率的影响。进分别比较了超纯水1，2，3，4，5 mL等5种体积对目标物洗脱效果的影响，结果如图5所示。

由图5可以看出，随着洗脱液体积不断增加，16种氨基酸平均回收率逐渐升高，但洗脱液体积达到3 mL以后再增加洗脱剂体积，回收率并没有明显增加，此时HLB固相萃取小柱中的目标物较完全地被洗脱出，再增加洗脱液体积对目标物回收率影响不大，所以选择3 mL为洗脱体积较合适。

2.6 加标回收与相对偏差

对Gly，Ala，Ser，Pro，Val，Thr，Ile，Leu，Asp，Lys，Glu，Met，His，Phe，Arg，Tyr等16种氨基酸进行加标回收率实验，设定3个梯度浓度，每个梯度测定5次，结果如表4所示。

图5 洗脱液体积对16种氨基酸平均回收率的影响

表4 方法的回收率及相对标准偏差(n=5)

表5 样品中16种氨基酸的测定(n=5) mg/100mL

由表4结果可知，16种氨基酸的3个梯度加标回收率范围为85.1%～96.2%，相对标准偏差为1.1%～5.2%，表明建立的方法具有可靠的准确度和精密度。

2.7 样品的测定

本研究对市场上常见的5种常见的运动型乳饮品进行16种氨基酸含量的测定，每个结果平均测定5次，具体结果如表5所示。

由表5可以看出，从市场上随机抽取的样品的质量差别很大，也可以看出不同种类的运动型乳饮品中含有的氨基酸的种类和含量差异较大，5款饮品中都含有Glu；而Ala，Ser，Pro，Val，Thr，Ile，Leu，Asp，Lys，Met，His，Phe，Arg这13种氨基酸只有个别样品中有；而Gly和Tyr在这5种样品中没有添加，整体氨基酸检测到的种类与产品外包装标签中标出的一致。针对分析测定的结果，我们可以根据自身的需要，选用不同类型的运动型乳饮品，来补充全面的或者单一的氨基酸，这样会达到更有效的补充目的。

3 结 论

本研究建立的SPE-UPLC-MS/MS检测运动型乳饮品中Gly，Ala，Ser，Pro，Val，Thr，Ile，Leu，Asp，Lys，Glu，Met，His，Phe，Arg，Tyr等16种氨基酸分析的方法。结果表明，样品经过Oasis PRiME HLB固相萃取小柱后，运动型乳饮品中杂质和干扰物质可有效地被去除，能准确快速有效地检测运动型乳饮品中16种氨基酸。并由实际样品的检测结果可知，整体氨基酸检测到的种类与产品外包装标签中标出的一致。针对分析测定的结果，我们可以根据自身的需要，选用不同类型的运动型乳饮品，来补充全面的或者单一的氨基酸，这样会达到更有效的补充目的。