马齿苋多糖对胃癌SGC7901细胞增殖和凋亡的影响

欧海玲 张秀玲 孙平良 张锡流耿曙光 覃宇周

胃癌是消化道最常见的恶性肿瘤，我国胃癌发病率居恶性肿瘤的第四位，死亡率居第二位［1］。手术、化疗是胃癌的常用治疗手段，但患者的总体治疗效果并不理想，5年生存率为25%～30%［2］，其中约50%的患者最终因腹腔种植转移死亡［3］。因此，寻找新的治疗药物和治疗途径是胃癌研究的热点。近年来，天然植物中的多糖成分由于其抗肿瘤作用具有高效低毒的特点而越来越受到重视。马齿苋多糖与其他植物多糖一样，作为生物反应调节剂，除了具有提高免疫力、抗衰老、抗氧化等作用外，还具有杀灭肝癌、宫颈癌等肿瘤细胞作用［4-6］。本研究主要探讨马齿苋多糖对胃癌SGC7901细胞增殖和凋亡的影响，为寻求新的胃癌治疗药物提供基础理论和依据。

1 材料和方法

1.1 细胞来源及主要试剂与设备

胃癌SGC7901细胞购自中国科学院上海细胞库；马齿苋多糖由广西中医药大学第一附属医院制剂室提取和分离；5-氟尿嘧啶（5-FU）购自上海旭东海普药业有限公司；RPMI 1640培养基购自Hyclone公司；胎牛血清购自Gibco公司；四甲基偶氮唑蓝（MTT）、PBS缓冲液、0.25%胰蛋白酶、AnnexinV-FITC/PI凋亡检测试剂盒均购自Bioswamp公司；超净工作台购自苏州金净净化设备公司；CO2恒温培养箱、移液器、酶标仪均购自Thermo公司；显微镜购自Nikon公司；流式细胞仪购自BECKMAN公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养及实验分组 胃癌SGC7901细胞培养于含10%胎牛血清、100 U/mL链霉素和100 U/mL青霉素的RPMI 1640培养液中，置于37℃、5% CO2培养箱中培养。传代时，取生长状态稳定，呈对数生长期的细胞，0.25%胰酶消化，加入RPMI 1640培养液将细胞吹打均匀，调整细胞至适当浓度后移入新的培养瓶中，3～4 d传代1次。实验分为马齿苋多糖组、阴性对照组及阳性对照组（5-FU组），其中马齿苋多糖组浓度依次为 25 μg/mL、50 μg/mL、100 μg/mL、200 μg/mL、300 μg/mL。

1.2.2 MTT法检测胃癌SGC7901细胞增殖情况 收集对数生长期的胃癌SGC7901细胞，调整细胞悬液浓度为 2×105/mL，接种于96 孔板中，置于37 °C、5% C02培养箱中培养24 h，然后处理细胞，马齿苋多糖组加入相应浓度（25 μg/mL、50 μg/mL、100 μg/mL、200 μg/mL、300 μg/mL）的马齿苋多糖液，阴性对照组加入0.9% NaCl溶液，5-FU组加入2.5 μg/mL浓度的5-FU，分别处理 12 h、24 h、36 h、48 h；吸去上清液，加入新鲜培养液，再加20 μL MTT溶液，继续培养4 h；再次吸去上清液，每孔加入150 μL Formazan溶解液，摇床上低速振荡10 min，然后在酶联免疫检测仪490 nm处测量各孔的吸光度值（OD）并计算细胞增殖抑制率。增殖抑制率（%）=（1-用药组OD值/对照组OD值）×100%。实验重复6次。

1.2.3 流式细胞仪检测胃癌SGC7901细胞凋亡情况 取对数生长期状况良好的胃癌SGC7901细胞，调整细胞悬液浓度为2×105/mL，接种于6孔培养板中，置于37℃、5% CO2恒温培养箱培养过夜，待单层细胞长至约80%时，按组处理细胞，马齿苋多糖组加入相应浓度的马齿苋多糖液，阴性对照组加入0.9% NaCl溶液，5-FU组加入2.5 μg/mL浓度的5-FU，分别处理 12 h、24 h、36 h、48 h；收集细胞，离心弃上清液，PBS 洗涤 3 次；加入 10 μL Annexin V-FITC 和 10 μL PI，轻轻混匀，4℃避光孵育30 min，然后用流式细胞仪检测细胞凋亡率。

1.3 统计学方法

采用SPSS 20.0软件进行统计学分析。以药物作用48 h的细胞增殖抑制率及凋亡率为主要评价指标，细胞增殖抑制率以计量资料［均数±标准差（±s）］表示，多组样本间均数比较采用单因素方差分析，多重比较采用Scheffe法检验。细胞凋亡率组间比较采用χ2检测，多重比较采用Bonferroni检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 马齿苋多糖对胃癌SGC7901细胞增殖的影响

MTT法检测结果显示，不同浓度（25 μg/mL、50 μg/mL、100 μg/mL、200 μg/mL、300 μg/mL） 的马齿苋多糖均可抑制胃癌SGC7901细胞增殖（P＜0.05），且细胞增殖抑制率随着作用时间的延长和药物浓度的提高而升高，其中药物作用48 h时，各浓度马齿苋多糖组的增殖抑制率均较前明显增加，其中200 μg/mL、300 μg/mL马齿苋多糖组增殖抑制率与5-FU组相当（P＞0.05）。见表 1和图 1。

表1 不同浓度马齿苋多糖作用胃癌SGC7901细胞的增殖抑制率（±s）Tab.1 The proliferation inhibition rates of gastric cancer SGC7901 cells treated with different concentrations of portulaca oleracea polysaccharide（±s）

表1 不同浓度马齿苋多糖作用胃癌SGC7901细胞的增殖抑制率（±s）Tab.1 The proliferation inhibition rates of gastric cancer SGC7901 cells treated with different concentrations of portulaca oleracea polysaccharide（±s）

aP＞0.05，vs the 5-FU group；bP＜0.05，vs the 5-FU group；cP＜0.05，vs thenegative control group

Proliferation inhibition rate（%）12 h 24 h 36 h 48 h Negative control 0 0 0 0 Group 5-FU 13.83±2.94c 29.83±3.54c 42.89±3.45c 56.36±3.26c 25 μg/mL 2.17±1.27bc 20.51±1.24bc28.35±1.49bc 38.01±1.33bc 50 μg/mL 10.23±2.58bc 24.05±4.56bc34.01±2.46bc 41.05±3.85bc 100 μg/mL 16.98±1.28ac 32.39±1.34bc42.85±5.57ac 51.05±1.57bc 200 μg/mL 24.01±4.76bc 37.01±3.28bc48.65±2.06bc 53.02±2.46ac 300 μg/mL 28.57±2.13bc 42.01±1.34bc51.99±1.04bc 57.20±2.14ac

图1 不同浓度马齿苋多糖对胃癌SGC7901细胞增殖的影响Fig.1 Effects of portulaca oleracea polysaccharide at different concentrations on the proliferation of gastric cancer SGC7901 cells

2.2 马齿苋多糖对胃癌SGC7901细胞凋亡的影响

流式细胞仪检测结果显示，药物作用48 h时，阴性对照组和5-FU组细胞凋亡率分别为0.73%和47.39%，不同浓度（25 μg/mL、50 μg/mL、100 μg/mL、200 μg/mL、300 μg/mL） 马齿苋多糖组细胞凋亡率依次为 31.92%、38.39%、40.45%、48.49%、55.71%。与阴性对照组比较，各浓度马齿苋多糖组的细胞凋亡率均明显升高（均P＜0.05），且随着马齿苋多糖浓度的增加，细胞凋亡率逐渐上升；与5-FU组比较，200 μg/mL浓度组细胞凋亡率差异无统计学意义（P＞0.05），25 μg/mL、50 μg/mL、100 μg/mL 组细胞凋亡率降低，而 300 μg/mL组升高，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表2、图2。

表2 不同浓度马齿苋多糖作用胃癌SGC7901细胞的凋亡率（%）Tab.2 The apoptosis rates of gastric cancer SGC7901 cells treated with different concentrations of portulaca oleracea polysaccharide（%）

3 讨论

我国胃癌具有发病率高、转移率高、死亡率高，而早诊率低的特点，化疗是胃癌综合治疗方案的重要组成部分，但化疗药物在杀伤肿瘤细胞的同时也会对正常组织造成伤害，致使部分患者难以耐受其毒性作用而终止治疗，治疗效果受到明显影响。近年来，从天然植物中提取多糖类物质用于抗肿瘤活性的研究已有不少报道。植物多糖作为生物反应的调节剂，主要通过增强凋亡途径、氧化呼吸功能途径和体内的免疫应答等杀伤肿瘤细胞［7］，对正常组织损伤较小。因此，若能筛选对胃癌细胞具有杀伤效应的植物多糖，则有望改善胃癌的治疗效果。

图2 48 h后不同浓度马齿苋多糖对胃癌SGC7901细胞凋亡的影响Fig.2 Effects of portulaca oleracea polysaccharide at different concentrations on the apoptosis of gastric cancer SGC7901 cells after 48h

马齿苋属马齿苋科植物，广泛分布在热带、温带地区，为药食同源的野生植物，含有丰富的化学成分，包括生物碱、黄酮类、有机酸、苷类、萜类、多糖等。药理研究显示马齿苋具有降血脂、降血糖、抗动脉粥样硬化、抗菌、抗氧化、防衰老、增强免疫以及抗肿瘤等作用［8-10］。其中马齿苋多糖便是有效的活性成分之一，目前也有少量研究初步探讨对马齿苋多糖抑制肿瘤细胞增殖、诱导细胞凋亡的影响。胡庆娟等［5］研究报道马齿苋多糖可显著降低肝癌HepG2细胞存活率，且促进细胞凋亡。牛广财等［11］也发现马齿苋多糖POPⅡ和POPⅢ均能显著抑制荷Lewis肺癌小鼠的瘤体生长，且可提高荷Lewis肺癌小鼠NK细胞及淋巴细胞转化的活性。在宫颈癌移植瘤中也发现马齿苋多糖能够抑制移植瘤生长，诱导癌细胞凋亡［12］；且能增强宫颈癌荷瘤小鼠细胞免疫功能，对小鼠U14宫颈癌实体瘤和腹水瘤可发挥抑制作用［6，13］。但马齿苋多糖与胃癌的研究鲜见报道。本研究用马齿苋多糖液干预胃癌SGC7901 细胞 48 h 后，发现 200 μg/mL、300 μg/mL马齿苋多糖组增殖抑制率可达（53.02±2.46）%、（57.20±2.14）%，而一般抑制率＞30%则认为抗肿瘤有效，因此提示在胃癌中马齿苋多糖同样显示了可抑制肿瘤细胞增殖的效果，与上述研究结果一致。此外，因5-FU是目前临床上用于消化道肿瘤化疗的有效药物之一，本研究进一步采用5-FU作为对照，结果发现以上浓度马齿苋多糖处理与5-FU处理的细胞增殖抑制率相当，再次说明高浓度马齿苋多糖的抑瘤活性与5-FU相当。本研究还发现马齿苋多糖组随着药物浓度的增加，细胞凋亡率逐渐上升，处理48 h，300 μg/mL马齿苋多糖组的胃癌SGC7901细胞凋亡率达到55.71%，明显高于5-FU组的47.38%，说明马齿苋多糖可能通过诱导细胞凋亡达到抗肿瘤目的。目前也有研究报道马齿苋多糖通过降低线粒体膜电位、增加细胞内的钙离子浓度、提高p53和Bax的基因及蛋白表达促进细胞凋亡［5］。但是，马齿苋多糖对胃癌SGC7901细胞的增殖抑制及诱导细胞凋亡的作用机制尚未知，有待后续进一步深入研究。