宫颈癌患者外周血细胞中miRNA-216b 的表达水平及临床意义

周艳齐，赵松兰，沈亚杰，于红风

镇江市第一人民医院妇产科，江苏 镇江2120000

宫颈癌是一种常见的妇科恶性肿瘤，容易蔓延或发生淋巴结转移，导致患者预后不佳[1-2]。大量研究提示宫颈癌发病与病毒感染尤其是人乳头瘤病毒（human papilloma virus，HPV）感染密切相关，但是其发病机制尚未完全明确。近年来随着分子生物学技术的飞速发展，研究发现宫颈癌的发生发展还涉及多基因的异常调控[3-6]。因此，寻找能够早期诊断和判断宫颈癌预后的分子标志物，有助于深入挖掘宫颈癌的发病机制，为宫颈癌的治疗提供新靶点和新思路。微小RNA（microRNA，miRNA）是一类长度为18～22 个核苷酸的短链非编码RNA，可以通过靶向识别信使RNA（messenger RNA，mRNA）的3'-非翻译区（untranslated region，UTR），在转录后水平调控靶基因的表达[7]。越来越多的研究表明，miRNA参与了多种复杂的生物学过程，包括肿瘤的发生和进展，并且不同肿瘤具有不同的miRNA表达谱[8-10]。然而，关于miRNA-216b在宫颈癌发生发展中作用机制的临床研究仍然较少。本研究采用实时荧光定量聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）检测宫颈癌患者外周血细胞中miRNA-216b 的表达水平，旨在探讨miRNA-216b 对宫颈癌诊断及预后判断的作用，现报道如下。

1 对象与方法

1.1 研究对象

选择2011 年7 月至2018 年7 月于镇江市第一人民医院就诊的55 例宫颈癌患者。纳入标准：经病理检查确诊为宫颈癌；初次诊断且未经过治疗。排除标准：合并其他恶性肿瘤；1 个月内有输血史。55 例宫颈癌患者的年龄为37～76 岁，平均年龄为（57.43±7.34）岁；体重指数（body mass index，BMI）为19.53～27.05 kg/m2，平 均BMI 为（21.48±4.22）kg/m2。另选取同期进行体检的健康者30 例作为对照，年龄为35～75 岁，平均年龄为（56.66±9.73）岁；BMI 为19.03～25.39 kg/m2，平 均BMI 为（20.95±4.08）kg/m2。宫颈癌患者和健康者的年龄、BMI 比较，差异均无统计学意义（P﹥0.05），具有可比性。本研究经医院伦理委员会审批通过，所有患者及家属均对本研究知情并签署知情同意书。

1.2 外周血细胞RNA 提取及逆转录

收集宫颈癌患者和健康体检者的外周血标本，其中宫颈癌患者的血标本采集于病理确诊和治疗前，1000 r/min 离心5 min 后去上清。将留取的外周血细胞通过Trizol 法提取总RNA，将RNA 置于冰上充分溶解45 min，采用Nanodrop 分光光度计检测其浓度及纯度，并将浓度全部标准化。采用miScript Reverse Transcription Kit（购自德国Qiagen公司）将上述标准化的RNA 逆转录成cDNA。反应体系配制完成后，按照说明书要求将其置于普通聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）仪中反应1 h。逆转录完成后，收集产物于4 ℃保存。将剩余的RNA 进行分装后置于-80 ℃保存。

1.3 实时荧光定量PCR

采用实时荧光定量PCR检测样本中miRNA-216b的表达情况，检测采用的试剂为miScript SYBR Green PCR Kit（购自德国Qiagen 公司）。每次实验均设置阳性和阴性对照。miRNA-216b 上游引物为5'-AAATCTCTGCAGGCAAATGTGA-3'，下游引物为miScript SYBR Green PCR Kit 中的通用引物；U6 上游引物为5'-GTGCTCCCTGCTTCGGCAGCACATATAC-3'，下游引物为5'-AAAAATATGGAACGCTTCACGAATTTG-3'。以U6 为 内 参，采用2-△△Ct法计算miRNA-216b 的相对表达量。

1.4 统计学方法

采用SPSS 18.0 软件对数据进行统计分析。符合正态分布的计量资料以均数±标准差（±s）表示，组间比较采用t 检验；不符合正态分布的计量资料以中位数（四分位数间距）[M（P25，P75）]表示，组间比较采用Mann-Whitney U 检验；计数资料以例数和率（%）表示，组间比较采用χ2检验。采用受试者工作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲线和曲线下面积（area under the curve，AUC）分析miRNA-216b 对宫颈癌的诊断效能。采用Kaplan-Meier 法绘制生存曲线，组间比较采用Log-rank 检验。以P﹤0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 宫颈癌患者和健康者外周血细胞中miRNA-216b的表达情况

宫颈癌患者外周血细胞中miRNA-216b 的相对表达量为0.011（0.005，0.026），明显低于健康者的0.109（0.047，0.255），差异有统计学意义（U=225.000，P﹤0.01）。ROC 曲线分析结果显示，miRNA-216b 能够鉴别诊断宫颈癌患者和健康者，其AUC 为0.865（95%CI：0.771～0.956，P﹤0.01），且其截断值为0.017 时，诊断灵敏度和特异度分别为63.6%和93.3%（图1）。

2.2 不同miRNA-216b 表达情况宫颈癌患者临床特征的比较

基于miRNA-216b 相对表达量的截断值0.017，将宫颈癌患者分为miRNA-216b 低表达组（n=35）和miRNA-216b 高表达组（n=20）。miRNA-216b 低表达组和高表达组患者的年龄、HPV 感染情况、病理分期、肿瘤直径比较，差异均无统计学意义（P﹥0.05）；miRNA-216b 低表达组患者临床分期为Ⅲ～Ⅳ期、有淋巴结转移、术后复发的比例均高于miRNA-216b 高表达组患者，差异均有统计学意义（P﹤0.05）。（表1）

表1 不同miRNA-216b 表达情况宫颈癌患者临床特征的比较（n=55）

2.3 生存情况的比较

随访过程中，所有患者的总生存时间资料均收集完整，但7 例患者的无病生存时间信息无法获取。miRNA-216b 高表达组患者的总生存情况优于miRNA-216b 低表达组，差异有统计学意义（χ2=5.704，P﹤0.05）；miRNA-216b 高表达组和低表达组患者的无病生存情况比较，差异无统计学意义（χ2=2.759，P﹥0.05）。（图2、图3）

图2 miRNA-216b低表达组（n=35）和高表达组（n=20）宫颈癌患者的总生存曲线

3 讨论

图3 miRNA-216b低表达组（n=29）和高表达组（n=19）宫颈癌患者的无病生存曲线

近年来，越来越多的研究证实miRNA-216b 参与了多种恶性肿瘤的发生发展，包括结肠癌、肝癌、胰腺癌等[11-14]。Yang 等[15]通过生物信息学分析发现，miRNA-338 和miRNA-216b 可能是宫颈上皮内瘤变发生发展中的关键miRNA。He 等[16]研究发现，miRNA-216b 可以通过抑制增殖相关蛋白（如cyclin D1、c-myc、p21、p-Rb以及LEF1）的表达，从而抑制宫颈癌细胞的增殖。此研究发现，miRNA-216b可以通过结合FOXM1 基因的3'-UTR 抑制其表达，从而发挥抗肿瘤作用。此外，宫颈癌组织标本和细胞株中miRNA-216b 的表达水平均下调，且miRNA-216b 低表达往往提示宫颈癌患者预后不良。本研究结果显示，宫颈癌患者外周血细胞中miRNA-216b 的相对表达量低于健康者，且miRNA-216b 对宫颈癌具有一定的诊断价值。由于外周血样本容易获得，因此外周血miRNA-216b 检测可辅助诊断宫颈癌，具有潜在的临床应用价值。

除了可以作为宫颈癌的诊断标志物，miRNA-216b表达水平还与宫颈癌患者的预后密切相关。本研究结果显示，miRNA-216b 低表达组和高表达组患者的年龄、HPV 感染情况、病理分期、肿瘤直径比较，差异均无统计学意义（P﹥0.05）；miRNA-216b低表达组患者临床分期为Ⅲ～Ⅳ期、有淋巴结转移、术后复发的比例均高于miRNA-216b 高表达组患者，差异均有统计学意义（P﹤0.05）。此外，生存分析结果显示，miRNA-216b 高表达组患者的总生存情况优于miRNA-216b 低表达组，差异有统计学意义（P﹤0.05）；然而，miRNA-216b 高表达组和低表达组患者的无病生存情况比较，差异无统计学意义（P﹥0.05），可能与病例数较少等因素有关。He 等[16]研究发现，宫颈癌组织中miRNA-216b 的表达情况与临床分期、总生存期及无病生存期密切相关。因此，可以初步判断无论从肿瘤组织还是外周血层面，miRNA-216 表达水平都可以作为判断宫颈癌患者预后的重要标志物。

综上所述，宫颈癌患者外周血细胞中miRNA-216b 表达下调，其可以作为辅助诊断宫颈癌和判断预后的重要标志物。