25%山苍子油水乳剂的研发及其对马铃薯晚疫病菌的防治效果

刘甜甜,张 星,熊兴耀,刘 韬,李晓刚,周 倩

(1.湖南农业大学 植物保护学院/植物病虫害生物学与防控湖南省重点实验室/植物疾病控制与利用湖南省高校重点实验室,湖南 长沙 410128; 2.邵阳市农业科学研究院,湖南 邵阳 422000;3.中国农业科学院 蔬菜花卉研究所,北京 100081; 4.沅江市农业农村局,湖南 沅江 413100)

马铃薯属茄科植物，块茎含有大量淀粉，可食用，能够提供人体所需的能量，因适合多种烹饪手法，受到大多数人的喜爱，目前已成为世界三大主粮之一，在解决全世界人民粮食安全问题上起着极为重要的作用[1]。致病疫霉(Phytophthorainfestans)引起的晚疫病一直以来严重威胁着马铃薯的生产。生产上多采用化学方法对马铃薯晚疫病进行防控，但这种方法污染大，且长期大量使用化学药剂易使病原菌产生抗药性[2]，目前已有病原菌对广泛使用的杀菌剂产生抗药性的报道[3]。因而，开发新型生物杀菌剂极为重要。山苍子(Litseacubeba)是樟科木姜子属的芳香油植物，是我国特有的植物资源之一，从山苍子的枝叶和果实中能够分离提取得到一种浅黄色液体，即山苍子油(Litseacubebaessential oil)[4]。山苍子油带有清鲜香甜的果香味并伴有鲜辣气息，具有易挥发的特性，在抗菌、抗氧化、抗肿瘤以及驱虫避害方面具有良好的开发利用前景，在化妆品、香料、食品等行业中被广泛应用[5]。近年来，关于山苍子及其提取物对植物病原菌的研究越加广泛，已有研究表明，山苍子油果实中的主要成分柠檬醛具有广谱抑菌活性，能够通过破坏细胞结构、增加细胞膜通透性、使细胞内容物外泄的方式导致菌丝死亡，对植物真菌、细菌病害具有良好的拮抗作用，极具开发应用价值[6-9]。另外，山苍子中的其他活性物质，如芳樟醇和香叶醇等，也与山苍子油抑菌作用有关，且质量浓度越高抑菌作用越强，随着质量浓度降低，抑菌效果出现急剧下降的现象[10]。郭丹等[11]研究了15种山苍子油主要成分及其衍生物对油茶炭疽病菌、西瓜枯萎病菌和水稻稻瘟病菌3种常见植物病原真菌的影响，结果发现，15种化合物对3种病原菌的生长均产生一定的抑制作用。目前，山苍子油对马铃薯晚疫病菌的抑菌作用研究尚未见报道。鉴于此，为明确纯植物提取物山苍子油对马铃薯晚疫病是否能够起到良好的抑菌作用，室内和田间防效是否表现良好，是否具有应用推广价值，研究了25%山苍子油水乳剂(EW)对马铃薯晚疫病的抑菌活性，并进行了室内及田间防效测定，旨在为山苍子油及其制剂应用于马铃薯晚疫病菌的防控提供依据。

1 材料和方法

1.1 供试菌株和药剂

马铃薯晚疫病菌强致病力生理小种菌种致病疫霉菌(P.infestans)CN152，由中国农业科学院蔬菜花卉研究所谢丙炎老师课题组提供。

25%山苍子油EW自制，其中含山苍子油25%、溶剂乙酸仲丁酯15%、乳化剂TSC-110 4%、乳化剂TSC-120 4%、分散剂SK-355 4%、增稠剂黄原胶0.3%、防冻剂乙二醇5%、去离子水补足至100%。上述原料混合，在剪切机中高速剪切乳化制得25%山苍子油EW。

银法利(687.5 g/L氟吡菌胺·霜霉威悬浮剂)购自德国拜耳作物科学公司。

1.2 试验地概况和供试马铃薯品种

试验地位于湖南农业大学植物保护学院试验基地。试验地土壤肥沃、地势平整，灌溉条件良好。试验所选地块环境条件均匀一致，符合田间试验要求。供试马铃薯品种为费乌瑞它，选取健康、无明显病斑的种薯，进行切块拌种处理后，放入已起垄、翻土和沤肥的试验地，种植密度为5.25×104株/hm2，于2018年1月开始种植。

1.3 培养基配制

黑麦培养基：黑麦草种子200 g、琼脂条20 g、去离子水1 000 mL，pH值6.0。

1.4 山苍子油对马铃薯晚疫病菌的抑菌作用初筛

采用平皿菌丝生长抑制法。取配置好的49 mL黑麦培养基微波炉加热约3 min，待培养基彻底融化后备用。适温(不烫手为宜)将除菌处理过的山苍子油加入到融化的黑麦培养基内，分别配置成500倍稀释和5 000倍稀释的山苍子油抑菌培养基，充分混匀，倒板，大风吹干备用，以添加灭菌水的黑麦培养基作为对照(CK)。将直径4 mm的马铃薯晚疫病菌菌饼接种至备好的平板中，18 ℃倒置暗培养约15 d，待对照培养基平板长满菌丝时进行观察记录，计算不同稀释倍数的山苍子油对马铃薯晚疫病菌菌丝生长的抑制率。

菌丝生长抑制率=(对照菌落直径-处理菌落直径)/(对照菌落直径-菌饼直径)×100%。

1.5 25%山苍子油EW对马铃薯晚疫病菌的室内抑菌试验

经1.4研究判定山苍子油对马铃薯晚疫病具有生防潜力后，对山苍子油进行加工配制，得到了25%山苍子油EW，进行山苍子油制剂的马铃薯晚疫病室内毒力测定。试验设计包括清水对照、药剂对照、25%山苍子油EW的3个处理，每个处理设3个平行，25%山苍子油EW处理和药剂对照分别进行5个梯度的稀释。25%山苍子油EW从稀释1 500倍开始，按1.2倍进行5个梯度稀释；药剂对照(银法利)从稀释5 000倍开始，按1.2倍进行5个梯度稀释。接种4 mm菌饼后倒置于18 ℃培养箱，暗培养约15 d，待清水对照处理长满菌丝后，观察、记录试验结果并拍照。

1.6 马铃薯晚疫病菌孢子悬浮液的制备及田间接种

田间接种前2周，将晚疫病菌接种于黑麦培养基上。接种时，先将长满晚疫病菌的平板上的游动孢子囊充分洗脱下来，于4 ℃诱导2 h，使游动孢子释放，并调整游动孢子浓度至1.0×105个/mL。

马铃薯齐苗后生长约1个月，选择天气预报有连续阴雨的时机，进行晚疫病菌接种试验。将准备好的游动孢子悬浮液采用活体喷雾接种的方法，均匀喷雾于马铃薯植株上，以在叶片上形成水滴为宜。

1.7 山苍子油制剂对马铃薯晚疫病菌的田间防效试验

试验共设3个处理：25%山苍子油EW、药剂对照(银法利)、清水对照(CK)。每个处理设3个重复，每个重复区域面积约为12 m2。于晚疫病菌接种前的晴天傍晚进行第1次药剂喷施(用量为1 500 mL/hm2，其中25%山苍子油EW稀释500倍，银法利稀释1 000倍，后面2次施药用量和浓度同此)，利用手动喷药器将药液均匀喷洒在马铃薯植株上。第2天接种晚疫病菌，接种后7～12 d的晴天傍晚进行第2次用药，再间隔7～12 d后进行第3次用药，最后1次施药完成7 d后进行马铃薯晚疫病发病情况调查，并记录施药当天天气情况。

采用五点取样法进行调查，观察发病情况，按叶片上病斑面积占整个叶面积的百分率进行分级(表1)。根据叶片病斑，计算病情指数与防治效果。

表1 病情分级标准

100%。

1.8 数据分析

使用Excel 2016进行数据处理。采用LSD两两差异检验显著性差异，P<0.05时，表示差异显著，P<0.01表示差异极显著。使用SPSS 19.0计算置信区间。

2 结果与分析

2.1 山苍子油对马铃薯晚疫病菌的抑菌作用初筛

通过平板抑菌试验，初步观察筛选山苍子油对马铃薯晚疫病菌的抑菌作用。结果(图1)表明，当对照平板上菌丝长满整个培养皿时，含有山苍子油的平板上完全没有观察到菌丝的生长。室内平板试验中山苍子油稀释500倍和5 000倍均能完全抑制马铃薯晚疫病菌菌丝生长，说明山苍子油具有开发作为马铃薯晚疫病植物源药剂的潜力。

图1 山苍子油对马铃薯晚疫病菌的抑菌效果

2.2 25%山苍子油EW对马铃薯晚疫病菌的室内抑菌作用

室内平板抑菌试验结果(表2)表明，25%山苍子油EW的1 500倍和1 800倍稀释液对马铃薯晚疫病菌的平板抑致率均达到94%以上。25%山苍子油EW的EC50为94.126 5 mg/L，银法利的EC50为2.619 6 mg/L，两者之间有效抑制中浓度存在显著差异。

表2 25%山苍子油EW及银法利的平板抑菌试验结果

25%山苍子油EW和银法利对马铃薯晚疫病菌的抑菌效果如图2和图3。由图2可见，在25%山苍子油EW的前2个稀释浓度下，只有极少量的菌丝生长，25%山苍子油EW稀释2 160倍的平板上明显可见菌丝生长，且菌圈面积接近培养皿面积的1/2，菌丝生长形态正常。由图3可以发现，在银法利的初始稀释倍数下虽然也有较好的抑制效果，但仍然可见生长出来的菌丝体，且银法利的多个稀释处理都出现菌圈的不规则生长现象，没有明显的菌圈边缘，十字交叉法测量的组间差异较大。

a—e分别为山苍子油EW在稀释倍数为1 500、1 800、2 160、2 592、3 110时的室内平板抑菌效果;CK为清水对照

a—e分别为银法利在稀释倍数为5 000、6 000、7 200、8 640、10 368 时的室内平板抑菌效果;CK为清水对照

2.3 25%山苍子油EW对马铃薯晚疫病菌的田间防效试验结果

由表3可见，25%山苍子油EW和银法利都表现出了对马铃薯晚疫病良好的防治效果，防效均达到了75%及以上。其中25%山苍子油EW的田间防效为75.00%；银法利的田间防效为80.05%，能够有效控制马铃薯晚疫病的发生危害，且银法利的田间防效稍优于25%山苍子油EW。综合上述结果，与清水对照相比，山苍子油EW和银法利对田间马铃薯晚疫病菌的侵染危害均表现出良好的抑制作用，在推荐用量下，银法利的防效稍好于山苍子油。

表3 25%山苍子油EW及银法利对马铃薯晚疫病的田间防治结果

3 结论与讨论

山苍子油作为植物源农药已经在杀虫方面取得很明显的效果[12]。吴均等[13]研究也证实，山苍子油在对细菌和真菌的防控上极具潜力。2013年，吴克刚等[14]研究了几种植物精油对铜绿假单胞菌的抗菌作用。其中，山苍子精油和香茅精油对铜绿假单胞菌具有较好的抑菌活性，最低抑菌量达到250 μL/L，且山苍子精油和香茅精油复配比为2∶3和3∶2时能够呈现出协同增效效果。2014年，李凤清[15]研究发现，山苍子精油对青霉、黑曲霉和酵母均有较好的抑菌活性，最低抑菌体积分数为1.49%～2.97%，最低杀菌体积分数为1.49%～5.94%。2014年，陈瑶等[16]研究表明，山苍子油对茶树炭疽病菌的EC50为142.79 mg/L，且与茶皂素配比具有增效作用。对比之下，本研究所使用的25%山苍子油EW对马铃薯晚疫病菌的EC50为94.126 5 mg/L，同样具有很好的抑菌活性。。

植物提取物对马铃薯晚疫病菌的抑菌作用早有研究，但能够达到良好抑菌效果的提取物浓度较高。2006年，王树桐等[17]研究结果表明，知母水提取物对马铃薯晚疫病菌菌丝生长的EC50为1.91×103mg/L。该课题组还研究了芒果苷对马铃薯晚疫病菌生长的抑制作用，其EC50为100.97 mg/L[18]。2007年，闵凡祥等[19]研究了苦参、瑞香狼毒等4种植物提取物对马铃薯晚疫病菌的抑制作用，4种提取物对马铃薯晚疫病菌都有明显的抑制作用，室内毒力最强的苦参醇萃取物EC50为1.77×104mg/L。25%山苍子油EW对马铃薯晚疫病菌的抑制中浓度为94.126 5 mg/L，抑菌浓度较低，抑菌有效性更高。

良好的田间防效对提高马铃薯产量和品质起到了重要作用。因此，该药剂具有推广意义。NGUYEN等[8]研究发现，山苍子油暴露于空气中2 h后即可发挥出强烈的抑菌作用，挥发时间对其抑制细菌生长的作用产生影响，山苍子油挥发时间越长，抑菌效果也越弱。建议针对当地晚疫病发生情况以及施药前后的天气情况，对药剂喷施方法适当进行改良，把握好施药的关键时期，使防控效果更加明显，同时，对药剂喷施的时间、次数和用量进行合理把控。

杀菌剂的长期使用可能会因在农产品和动物制品中的富集而导致威胁人类健康的问题[20]。有研究表明，对卵菌病害有效的本酰胺类化合物，由于其主要作用于二倍体致病菌而易使病原菌产生由单个主效基因控制的抗性因子[21]。植物源农药复杂的成分和作用机制，能够在病害的防治过程中减少这种情况的发生。

植物源农药的提取物质具有复杂的活性成分，其作用位点也极具多样性，同一物质对不同病原菌的作用机制和抑制方式也经常不同。周翠等[21]对1株芽孢杆菌的挥发物质与不同病原菌的互作进行研究发现，该挥发物质对不同病原菌的作用机制和作用方式不同，对葡萄白腐病菌的作用机制是使菌丝分支增多，对杨树腐烂病菌是使菌丝变粗，对合欢枯萎病菌则是使菌丝变细。山苍子油中具体哪些成分对马铃薯晚疫病菌具有抑制效果目前还不清楚，但已有研究表明，山苍子油中的主要成分柠檬醛及其衍生物对多种真菌菌丝生长及产孢等均具有良好的抑制效果[22]，其抑菌机制也值得进一步探索。

本试验进行了25%山苍子油EW对马铃薯晚疫病菌的室内平板抑菌试验和田间防效研究，结果表明，25%山苍子油EW制剂对马铃薯晚疫病菌表现出良好的防效。在室内毒力测定试验中，25%山苍子油EW对马铃薯晚疫病菌的EC50为94.126 5 mg/L，田间防效达到75.00%。虽然防治效果稍逊于银法利，但由于其是纯天然制剂，能减少化学农药对环境造成的不良影响，对其进行研究和开发，可为防治马铃薯晚疫病探寻新的途径。