兰科种子非共生萌发研究进展

齐凌雲，周芳美

（浙江中医药大学，浙江 杭 310000）

兰科植物可以通过种子培养进行快速繁殖，虽然没有功能胚乳，但是在自然条件下有适宜的共生菌参与可以进行萌发，可是萌发率低、数量少。原始环境的毁坏和人为过度采挖，加之种子本身的萌发条件十分苛刻，致使野生资源在原始生境的恢复异常艰难，造成野生兰科植物极度濒危。研究表明，种苗快繁是实现濒危兰科植物资源再生和合理开发利用的有效途径，而种苗快繁技术的核心在于种子萌发[1]。目前大多采取人工接种共生真菌的方法来促使兰花种子共生萌发；相比共生萌发，非共生萌发技术通过人为控制无菌环境，提供营养物质使许多兰科植物的萌发和繁殖更加可靠，是研究兰科植物生长发育的理想途径。本文从兰科种子的收集和预处理，对于其非共生萌发的处理和影响因素，以及使用非共生萌发的方法使其实现快速繁殖等方面的研究进行综合概括。

1 兰科植物与非共生萌发

关于兰科种子的繁育方法，非共生萌发不需要真菌的参与，操作过程简便，成本低，能在短期内获得大量的幼小植株大大增加了兰科植物规模化培养的可行性，是有效、快速的繁育方法之一。目前对于兰科种子非共生萌发体系的系统研究较少，而大多集中于利用不同种类的内生菌来促进兰科种子的萌发，操作过程相对繁琐，不利于实现兰科植物的规模化繁殖。目前研究表兰科植物的种子储存方便，且蒴果种子容易消毒，污染率低，采用非共生萌发优势明显。

1909年，Bernard以眉兰属的块茎配制培养基，首次使卡德丽亚兰与蕾丽亚兰杂交种子成功萌发[2]。随后，Arditt用非共生萌发法使不同类别的兰花种子萌发，并成功培育出正常的种苗，其中有齿瓣兰、石斛兰、蝴蝶兰、文心兰、兜兰等[3]。

兰科种子实现非共生萌发的培养条件主要包括种子成熟度，温度，光照，基本培养基的种类，植物激素（生长素类、细胞分裂素及其浓度配比），氮源，碳源（蔗糖、果糖、葡萄糖、海藻糖等），活性炭的添加，天然有机物提取物（土豆汁、香蕉汁、椰汁等）等[1]。通过控制这些影响因素可以调节兰科种子的萌发，使得兰科种子的活力更强、萌发速度更快、萌发率更高。

2 种子的收集和预处理

2.1 种子的收集和保存

兰科植物蒴果内种胚的成熟度决定着兰科植物的种子非共生萌发的萌发率，经查阅文献发现种胚成长到20周时开始采集最好，这时种子含胚的概率最大，萌发率近乎100%，萌发所需时间为1周，且收集蒴果应在种子成熟但果荚尚未开裂前进行。一般收集和有效保藏种子的方法是在超净工作台上，先将蒴果浸入70～75%乙醇中消毒30s，后使用2.5%NaCLO溶液进行表面消毒15min，接着用无菌水冲洗数遍，随后用无菌滤纸吸去残留水分，最后使用无菌手术刀纵向切开蒴果，取出种子待用。乙醇、NaClO溶液浓度和消毒时间的确定可根据蒴果大小等因素酌情调整，运用的前后顺序可视具体情况进行改变[1]。

成熟兰科植物的种子在含水量大且贮藏温度高的环境下，易发霉变质，失去生命力，贮藏时环境的温度以及相对湿度越高，种子的退化速度就越快。在贮藏中，运用低温技术具有显著抑制种子中微生物生长的作用。微生物完成生命活动的最适温度是在21～27℃之间，低温可以延长种子的寿命，温度降到0℃左右时，虽然仍有少量微生物能够继续发育，但其中大部分则是非常缓慢的。因而在贮藏种子时，应将其装入密封的塑料袋，放置在0～5℃的冰箱里。研究表明在播种前将种子放置于低温黑暗环境中，有助于破坏种子休眠，从而提高萌发率。此外，种子的含水量多少同贮藏过程中影响种子生存的其他因素之间的关系是非常重要的。为实现种子的长期储藏需要排除各种有害因素，如种子含水量需小于9%，这样可有效减缓种子的陈化过程。

2.2 种子的预处理

研究证实，种子经过恰当的预处理后可以有效提高种子的萌发率。这是由于有萌发抑制性物质（如木质素）存在于兰科植物种子的种皮中，或是由于种皮自身妨碍了种子对氧气及水分的吸收[1]。所以，为了促进兰科种子的萌发，实现兰科植物的快速繁殖，现使用较多的种子预处理方法主要分为物理、化学和生物三个方面。

物理上普遍采用磁性棒搅拌或超声波法消除这种由种皮产生的抑制作用。化学上则用KOH、NaOH、NaClO等溶液来破坏种皮并且达到消毒的效果。如刘思思等人发现用Ca（ClO）2划破外种皮，之后在4～8℃下低温层积8～12周可以提高陆生兰种子的萌发率[1]；沈宝涛用NaOH溶液处理兰科植物见血清种子推断NaOH溶液的浓度及处理时间对种子萌发有极大的影响[4]。生物上可以用蜗牛酶等处理种子，沈宝涛对见血清种子的试验表明适宜的蜗牛酶浓度在合适的处理时间下可明显提高种子的萌发率，萌发率高于对照组，最高可达71.03%。除此之外，低温层积也是常用的预处理方法之一。这些种子的预处理方式都可以不同程度的影响兰科种子的萌发，对兰科种子的非共生萌发以及快速繁殖的研究意义重大。

兰科种子的胚发育不成熟，那么在萌发的过程中就无法提供充足的养分，致使种子萌发困难。在兰科植物的无菌培养中对种子的合理处理可以大大提升种子的萌发速度和萌发率。采集和有效保存种子是实现兰科植物种质资源可持续利用的前提，种子的预处理更是可以促进种子的快速萌发。找到有效的种子收集和预处理方式可以为珍贵药用兰科植物的快速繁殖带来福音。

3 影响种子萌发的因素

兰科种子非共生萌发的影响因素包括种子成熟度、温度、光照、培养基种类和成分以及天然提取物等。

3.1 种子成熟度对种子萌发的影响

种子成熟度是影响种子萌发率的关键因素，在兰科植物地生兰中普遍存在未成熟种子的萌发率高于成熟种子的现象。Kaur S等人证明秀丽兜兰未开裂之前的蒴果的种子较开裂后更易发芽[5]。其原因可能与不同时期种子种皮的机械阻力大小和透水透气性、种胚发育程度、储存的营养物质含量及可能存在的抑制物质等有关。

3.2 温度对种子萌发的影响

兰科植物种子的培养温度普遍保持在20～30℃，大多数以25℃为宜。通常情况下，兰科植物种子在这个温度范围内均能萌发，但不同种类的兰科植物均有其最适的温度区间，例如研究普遍认为铁皮石斛生长的最适温度为25℃左右。此外，在种子的预处理阶段，研究表明将种子置于0～5℃或25℃的环境下保存一段时间，有助于打破种子休眠，提高萌发率且后者作用更显著。华梅等人在对文山兜兰种子非共生萌发的研究中发现种子在播种前经过低温处理73d后，文山兜兰种子萌发时间可提前13d，萌发率达到59.33%[6]。

3.3 光照对种子萌发的影响

有资料显示，兰科植物种子的感光不是必需的而是光促进类型。兰科植物种子所需的光照周期因种而异，不同种类的种子有些需要全暗培养而有些则需要光暗交替培养，李雨晴的试验证明白及种子无菌萌发初期给予光照可提高萌发率，暗培养的白及种子萌发率显著低于光照培养[7]。Philip等的试验证明黑暗条件可以促进Calopogon tuberosus的种子萌发[8]。二者的研究同时表明当种子发育到原球茎阶段需给予适当光照对幼苗的生长和发育有益处。

3.4 培养基的种类、组分及培养方式对种子萌发的影响

3.4.1 基本培养基的种类对种子萌发的影响

通过查阅文献整理出几种不同类别兰花的非共生萌发培养基配方，如表1所示。通常使用的培养基有MS、1/2MS、RE、KC（Kundson C）、花宝 （Hyponex）等，不同兰花种子在不同培养基上萌发率存在着一定差异。据研究表明，MS或者1/2MS培养基具有无机盐和离子浓度较高、溶液离子平衡相对稳定、养分含量及比例适宜等特点，能够迎合兰科植物的营养以及生理需求，故其应用较其他基础培养基更多。

表1 几种兰花非共生萌发的培养基配方

3.4.2 培养方式

兰科植物非共生萌发利用的培养基是由人工配制的，促进和保障植物组织生长的养料。按照培养基的物理状态可将其分为固体和液体两种类型。固体培养的转接次数少，节约劳力和设备投入。然而有研究表明，液体悬浮培养通过与兰科种子充分接触更有助于种子萌发，表现在种子萌发提前，原球茎颜色翠绿且形态饱满，生长速度快，同时在液体培养基上继续培养不易分化。华梅等人在对文山兜兰种子非共生萌发的研究中发现文山兜兰种子在液体悬浮培养基中无论萌发时间还是萌发率上都明显优于固体培养基，并且以花宝1号作为培养基能明显提高萌发率[6]。Thompson等开创性地采用双相培养基，以增进南非Disa属的兰花不成熟种子萌发，培养基由富含活性炭的固态培养基和覆盖在其上的降低强度的相同类型的液体培养基构成。前者用来消弥过滤后的苯酚的影响而且使得原球茎形成极性，并且后者能有效增强水的利用。相比旧的培养方法，种子萌发的速度更快，而且许多种类的种子萌发率接近于它们的估计萌发潜力[13]。

3.5 天然提取物与活性炭对种子萌发影响

天然提取物如香蕉匀浆、椰子汁等含有氨基酸、激素和酶等的有机物，是成分相对复杂的天然复合物，添加适宜种类和浓度的天然提取物对种子的萌发有显著的促进作用，这一结论已有诸多论证。然而，如果培养基中添加了不适宜的天然提取物，不但不会促进萌发，甚至会带来不利影响，如唐丽等人对铁皮石斛的研究中发现适量马铃薯可以促进种子萌发而添加椰乳则对其有不利影响[14]。

活性炭能吸附分泌到培养基中的抑制性的和有害的物质，对抑制褐变有显著作用，这样可以大大减少已萌发种子的死亡率，但由于活性炭也有副作用，即活性炭的加入常使培养基的成分变得复杂，因此在培养时需根据物种选择是否添加。

综合上述影响因素，通过对种子进行预处理，合理控制温度和光照等因素，选择合适的培养基和培养方式，优化改良培养基配方能够有效促进种子萌发。

4 问题与展望

非共生萌发是植物快速繁殖的一种方式，相比于自然环境下生长的植物，它能够避免人为和自然的灾害，保持稳定的生长，进而让珍稀植物保持一定的数量，被人们所利用，但是目前的技术还不能够广泛应用，仍存在以下问题：第一，实验对环境要求严苛，过程中需要保证无菌环境。第二，在有效保存种子的问题上，需要严格控制好试剂用量以及贮存条件。第三，兰科种子的胚发育不完全，在萌发过程中要提供足够的养分以及合适的处理。

珍稀兰科植物具有很高的药用价值，随着对兰科植物的需求不断增加，其数量因自然与人为因素的制约逐渐无法满足需求，人们也很少在珍稀兰科植物的快速繁殖上开展大量工作。今后，人们对于药材的培养与保护会更加重视，更多的创新技术会在这个领域应用和体现。让兰科植物实现快速繁殖，提高药材的数量和品质，能够在资源保存和获取方面取得重大突破，展现出无可比拟的优势与前景，开拓了广阔的市场。因为兰科植物在自然环境下的生长遭到阻碍，所以需要依靠非共生萌发技术，帮助其发育成长，这将会对医药学事业做出巨大贡献。