Nintedanib对碱烧伤大鼠角膜新生血管的抑制作用

刘小天，龚雁，周璐

(宁波市眼科医院 1.眼科；2.药剂科，浙江 宁波 315040)

角膜碱烧伤是常见的眼科急重症，其引起的角膜新生血管(corneal neovascularization，CNV)是十分常见的眼病，约占整个角膜疾病的10%[1]。CNV形成通常与眼表和角膜的炎性、感染性、创伤性、毒性、退行性或免疫性疾病相关[2-3]。由于水肿、瘢痕形成或脂质沉积，CNV可能导致严重的视力损害甚至失明[4]。目前对CNV的治疗主要包括抗炎药物、光动力疗法、激光光凝以及结膜、角膜缘或羊膜移植，而所有这些医疗和外科干预措施的临床疗效有限，不良反应也不少[5]。在CNV生成的过程中，CNV由多种刺激和抑制因子调节[6]，而在各种促血管生成因子中，血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)家族在刺激内皮细胞增殖和新生血管形成中起至关重要的作用[7]。其中的血管内皮细胞生长因子受体2(vascular endothelial growth factor receptor-2，VEGFR-2)的酪氨酸激酶在介导VEGF诱导的内皮细胞增殖、迁移，毛细血管形成及其渗透性方面起重要作用[8-9]，尼达尼布(Nintedanib)是一种酪氨酸激酶抑制剂。近年来，根据CNV的形成机制，越来越多的药物已经被研究出来，但Nintedanib与CNV生长及消退的关系国内报道尚少。本研究使用不同浓度Nintedanib滴眼液滴眼，并通过裂隙灯显微镜、病理及免疫组织化学等不同方法，观察碱烧伤后CNV生成及抑制情况，探讨Nintedanib治疗角膜碱烧伤的作用，为新药开发及该病治疗提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物与分组

选用上海SLAC实验动物有限公司的成年SD雄性大鼠30只，体重为200～300 g，符合国家医用动物使用标准。用裂隙灯显微镜检查大鼠眼角膜正常。采用随机数字表法将大鼠分为5组，每组各6只。A组、B组、C组分别给予0.2%，0.05%，0.02%的Nintedanib滴眼液滴眼，D组给予0.1%地塞米松滴眼，E组给予生理盐水滴眼。

1.2 主要试剂与仪器

主要试剂与仪器包括裂隙灯显微镜数字图像处理系统(日本，TOPCON SL-D2)、眼科手术器械(显微剪刀、显微镊子，苏州市协和医疗器械有限公司)、重组Anti-CD31抗体、山羊抗兔IgG H&L(Abcam公司，上海)、VEGF抗体(武汉三鹰生物技术有限公司)、Nintedanib(上海生工生物有限公司)、苏木精-伊红染色试剂(北京中杉金桥生物技术有限公司)、切片机、脱水机(德国徕卡公司)。

1.3 建立大鼠角膜碱烧伤新生血管生长的动物模型

5组均以相同的方法制作左眼碱烧伤CNV模型。碱烧伤模型制备前1 d予以左眼氧氟沙星滴眼液和1%阿托品眼液点眼，用乙醚全身麻醉，碱烧伤时在模具内滴入200 μL 1 mol/L NaOH溶液后，将模具垂直放置于大鼠左眼角膜中央，40 s后取出，迅速用生理盐水冲洗结膜囊1 min。烧灼角膜后立即滴入各组滴眼剂，4次/d，每次间隔5～6 h。实验结束后，常规滴用氧氟沙星滴眼液4次/d，1滴/次，用药3 d，预防感染。同于给予阿托品点眼扩大瞳孔，便于观察新生血管。SD大鼠饲养于宁波大学SPF级动物实验室，本研究所采用的各种动物实验操作均经动物管理委员会批准。

1.4 Nintedanib滴眼液的制备和干预方法

以10%的2-羟丙基环糊精作为增溶剂，磷酸钠单水合物作为缓冲剂，氯化钠为增稠剂，注入水，配成无菌、不含防腐剂的等张液，20 min 37 ℃水浴至完全溶解，控制pH值为7.3～7.5。根据溶解度观察，并以半个log递减，配置成0.2%，0.05%，0.02%的Nintedanib滴眼液。5组滴眼液于4 ℃冰箱保存，各组大鼠均于造模当天开始滴眼。每组 4 次/d，共 14 d。

1.5 裂隙灯检查和 CNV 面积

每组大鼠分别于碱烧伤后第3，7，14天裂隙灯下观察大鼠角膜创伤愈合、炎症反应及CNV生长情况的图像，于角膜碱烧伤后第3，7，14天照相，并通过ImageJ软件计算CNV的面积占全角膜面积的百分比(图1)。观察是否存在前房出血、角膜溃疡及眼内炎，将发生严重前房血、角膜溃疡穿孔及眼内炎者剔除。

1.6 HE染色与免疫组织化学检测

造模后第14天，颈椎脱臼处死所有小鼠。取带1 mm宽巩膜的全角膜，置于4%甲醛溶液中进行组织病理学检查固定24 h，随后用PBS冲洗除去甲醛后，将标本包埋在石蜡中，冷却凝固。将石蜡块切成4～5 mm厚，切片用HE染色。切片脱蜡至水，加入3% H2O2液中10～20 min，水洗(抑制内源性过氧化物酶活性)，枸橼酸缓冲液热处理修复15～20 min。PBS洗3次，滴加10%正常血清封闭30 min(室温或37 ℃)，滴加稀释的一抗(VEGFG-2以1:400稀释，CD31以1:2 000稀释)，湿盒内37 ℃孵育60 min或4 ℃过夜。PBS洗5 min，3次，滴加荧光二抗(均以1:200稀释)，37 ℃孵育30～40 min，PBS洗5 min，3次，DAPI染核封片，细胞质内或核膜上呈绿色、蓝色者为阳性，不显色的为阴性。利用图像分析仪(Image Pro Plus 6.0)测定免疫荧光染色阳性反应物的IOD值以反映各组标本检测的蛋白相对含量。

1.7 统计学处理

采用SPSS 17.0软件进行统计学分析。计量资料以均数±标准差()表示，多组间数据比较采用完全随机设计资料和随机区组资料的方差分析，检验水准：α=0.050。P＜0.05为差异有统计学意义。

图1 通过ImageJ软件计算角膜新生血管的面积占全角膜面积的百分比Figure 1 The percentage of the area of corneal neovascularization to the total corneal area calculated with ImageJ software

2 结果

2.1 裂隙灯显微镜下观察各组大鼠 CNV

采用裂隙灯显微镜下观察各组大鼠CNV，大鼠角膜碱烧伤后第3天，A组、B组和C组中角巩膜缘血管扩张，未见明显的新生血管生长；D组、E组角膜浅基质层轻中度混浊，可见新生血管出芽，由周边角膜缘向角膜中间蔓延，血管生长致密，相互交叉成网。碱烧伤后第7天，A组、B组、C组和D组新生血管管径细小，多集中于角膜缘且生长缓慢；与B组、C组相比，A组新生血管少；D组、E组水肿明显，新生血管生长旺盛，血管显著变长、增粗，并在顶端出现分叉，虹膜上遍布呈刷状的血管。碱烧伤后第14天，A组与B组血管床附近细小血管基本退化，分布局限且稀疏；A组新生血管的生长范围、数量及长度均较B组与D组轻；C组、E组新生血管面积较大，CNV呈粗大致密(图2)。

2.2 CNV 面积及其在角膜面积的占比

碱烧伤后第3，7，14天，通过ImageJ软件测算五组CNV面积在角膜面积中的占比(C/N)(图2)，结果显示：碱烧伤后第3天，A组、B组与C组、D组、E组比较，差异有统计学意义(P＜0.01)，同时C组和E组比较，差异无统计学意义(P＞0.05)，第7天、第14天，A组、B组、C组和D组的C/N均小于E组，差异均有统计学意义(均P＜0.01)，其B组、D组的差异均无统计学意义(均P＞0.05)，但B组、D组分别A组、C组比较，差异均有统计学意义(均P＜0.01；图3，表1)。

2.3 常规病理切片观察

碱烧伤后第3天，五组的角膜均出现上皮细胞肿胀，烧伤区可见部分上皮细胞缺如，细小点状炎性细胞浸润，未见前弹力层结构，A组近角膜缘处浅基质层可见CNV管腔，管径较小，其中D组、E组见上皮细胞水肿更明显，炎性细胞浸润范围更大。制模后第7天，A组可见角膜基质层结构整齐，少许新生血管管腔，角膜内少量炎性细胞浸润；B组、D组角膜基质层结构较整齐，新生血管管腔稀疏，炎性细胞浸润；C组、E组可见角膜上皮层变薄，基质层炎性细胞浸润，伴有大量毛细血管。碱烧伤后第14天，A组、B组、D组角膜上皮细胞均较完整，上皮层及基质层水肿消退，基质层见新生血管管腔，其中A组管腔较小，炎性细胞较前减少明显，C组、E组仍可见上皮及基质层的水肿及炎性细胞浸润(图4)。

图2 碱烧伤后第14天，以裂隙灯显微镜观察大鼠碱烧伤后角膜Figure 2 On the 14th day after alkali burn,the corneas of rats were observed by slit-lamp microscope

图3 第3，7，14天各组CNV面积在角膜面积中的占比(C/N)的比较Figure 3 Histogram of CNV area in corneal area (C/N) in each group on the 3rd,7th and 14th day

表1 应用方差分析比较各组CNV面积在角膜面积中的占比(n=6)Table 1 Analysis of variance was used to compare the proportion of CNV area in corneal area (n=6)

图4 第14天，各组角膜组织HE染色(×200)Figure 4 HE staining of corneal tissue in each group on the 14th day (×200)

2.4 免疫组织化学检测VEGFR-2与CD31蛋白的表达

正常大鼠角膜无新生血管，CD31蛋白不表达，VEGFR-2在上皮层角膜扁平上皮细胞、基底细胞呈弱阳性。角膜碱烧伤后第14天，各组角膜VEGFR-2和CD31蛋白表达增强，与A组、B组、D组比较，C组、E组CNV旺盛更为致密，呈现深绿色染色的CD31和VEGF蛋白表达较强，差异有统计学意义(P＜0.01)，VEGFR-2蛋白主要见于角膜上皮细胞及基质新生血管内皮细胞质；在表达较弱的三组里，A组的CNV最少，差异有统计学意义(P＜0.05)，CD31和VEGF蛋白表达增强，B组和D组差异无统计学意义(P＞0.05，表2，图5，图6)。

图5 角膜碱烧伤后第14天，各组角膜VEGFR-2与CD31蛋白表达Figure 5 Expression of VEGFR-2 and CD31 proteins in rat cornea in each group on the 14th day after alkali burn

表2 第14天，各组VEGFR-2和CD31免疫荧光IOD值(n=6)Table 2 Fluorescence IOD of VEGFR-2 and CD31 in each group on the 14th day (n=6)

图6 第14天各组VEGFR-2蛋白和CD31蛋白表达比较Figure 6 Expression of VEGFR-2 and CD31 protein in each group on the 14th day

3 讨论

病理性CNV与感染或化学灼伤引起的炎症有关[10]。角膜碱烧伤可导致破坏性并发症[11]，是造成大面积CNV形成的重要原因。CNV的形成与VEGF的过度表达密切相关[12]。尽管血管生长可以修复其部分影响，但CNV和高通透性可能导致视力受损和移植失败[13]。前期的研究[14]发现：用贝伐单抗进行结膜下注射或直接滴眼，能在一定程度上减少CNV的形成。本研究所选取的Nintedanib是新一代VEGFR-2酪氨酸激酶抑制剂。VEGFR的酪氨酸激酶是VEGF信号转导的起点，受体介导而被激活，阻断该位点可以有效抑制VEGF介导的血管生成作用[9]。VEGFR-2酪氨酸激酶抑制剂可以抑制血小板源生长因子受体(platelet-derived growth factor receptor，PDGFR)、成纤维细胞生长因子受体(fibroblast growth factor receptor，FGFR)和血管内皮生长因子受体(vascular endothelial growth factor receptor，VEGFR)。由于其损伤修复机制中能靶向作用于生长因子受体，临床上已将其应用于癌症及肺间质纤维化(idiopathic pulmonary fibrosis，IPF)的治疗中[15-16]。最新的关于VEGFR-2酪氨酸激酶抑制剂[阿帕替尼(apatinib)]对CNV作用的研究[17]显示：结膜下注射以纳米颗粒为载体的apatinib(Apa-HSAPEG)可以有效地控制碱化学烧伤后CNV的生长。但定期结膜下注射对患者结膜的刺激性较大，同时增加了患者的就医负担。因此，在临床上使用更便捷、损伤更小的滴眼液是否能达到更好的效果尚未可知。

本研究结果显示：在使用不同浓度的Nintedanib后，动物模型的CNV出现不同程度的抑制。取制模后第3，7，14天3个时间点对CNV面积在角膜面积的占比(C/N)进行测量，在第3天时，除C组外，其余三组的C/N较对照组有减少，A组、B组的C/N均较对照组有明显减少，C组与对照组间的差异无统计学意义，在第7，14天时，各干预组C/N均小于对照组，其中A组的效果最好，B组和D组效果次之，其差异无统计学意义。说明Nintedanib溶液随着浓度的升高，尤其是在第7天后CNV的面积出现了减少的趋势，其抗新生血管生成的作用逐渐增强。同时，观察第3，7，14天的炎性细发现，制模后第7，14天3个治疗组的炎性细胞密度降低，表明Nintedanib对炎性细胞有一定的抑制作用。本研究结果表明：碱烧伤后的CNV生长是一个多因素共同作用的结果，而VEGF仅是其中重要的一环。不同浓度的Nintedanib对其他炎性因子和细胞通路的影响，还需进一步的研究。

VEGFR-2是内皮细胞中介导VEGF信号的功能性受体，与血管生成密切相关，其特异性地表达于血管内皮祖细胞和血管内皮细胞上，VEGF与VEGFR-2结合后VEGFR发生自磷酸化，继而诱导内皮细胞的生长，促进内皮细胞的移行、出芽、血管渗漏和新生血管的形成[18]。血管内皮细胞具有CD31蛋白的特异性细胞表面标志物，其表达水平与新生血管的生成相关[19-20]。因此，本研究中使用VEGFR-2和CD31蛋白作为评估CNV的标志物。在本研究中，角膜碱烧伤后第14天，免疫荧光检测发现各组角膜VEGFR-2蛋白表达增强，而与A组、B组和D组比较，C组、E组VEGFR-2蛋白阳性表达明显增强，这证明Nintedanib能够通过抑制VEGF的表达来抑制CNV；同时A组中VEGFR-2和CD31蛋白的表达量均最低，B组与D组的效果相当，说明0.2%浓度的Nintedanib滴眼液抗CNV效果优于0.1%地塞米松和0.05% Nintedanib，而0.02%Nintedanib几乎没什么效果。

本研究使用了Nintedanib局部滴眼的方法，通过观察其发生发展情况及角膜内VEGFR-2和CD31蛋白的表达情况，观察CNV与VEGFR-2和CD31蛋白表达的时空一致性，结果证实Nintedanib可以减少碱烧伤引起的CNV，降低VEGFR-2和CD31蛋白的表达及炎症因子水平，其中0.2% Nintedanib滴眼液的效果最好，为新药研发及临床防治碱烧伤引起的CNV治疗提供了新的思路。