合欢花HPLC指纹图谱模式识别及含量测定研究

1.贵州医科大学民族药与中药开发应用教育部工程研究中心/省部共建药用植物功效与利用国家重点实验室，贵州 贵阳 550004；2. 贵州医科大学药学院，贵州 贵阳 550004；3. 贵州医科大学贵州省药物制剂重点实验室，贵州 贵阳 550004

合欢花又名夜合欢、合欢米，为豆科植物合欢AlbiziajulibrissinDurazz.的干燥花絮或花蕾，其性平，味甘，归心、肝经，具有解郁安神、镇静催眠的功效，临床多用于治疗虚烦不眠、抑郁不舒等症[1-3]，在华东、华南、辽宁及陕西等地均有分布[4]。合欢花化学成分主要有以异槲皮苷、槲皮苷、槲皮素为代表的黄酮类化合物和挥发油等，其中槲皮苷含量最高，且对中枢神经系统有抑制活性，具有镇静催眠作用[5-8]。

中药材化学成分复杂，表现出多成分、多靶点的作用特点，通过单一指标的量难以全面反映药材质量的优劣[9-10]。指纹图谱具有整体性高、特征性强等基本属性，在质量综合评价中起到十分重要的作用，化学模式识别能对指纹图谱的多维信息进行分析处理，使指纹图谱信息得以充分表达，已广泛应用于多种中药的质量控制研究[11-15]。本研究建立合欢花HPLC指纹图谱，并对其进行模式识别分析，结果表明槲皮苷是导致药材质量差别贡献最大的化学成分，为质量标志性成分，因此，对槲皮苷进行含量测定研究，以期为其质量评价提供科学依据。

1 仪器与材料

1.1 仪器 UltiMate 3000高效液相色谱仪(美国Thermo Fisher Scientific公司，包括系统控制器、输液泵、脱气组件、低压梯度组件、自动进样器、柱温箱、温控样品室、UV-DAD检测器及Chromeleon 色谱数据工作站)；Mettler AE-240型电子天平(梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司)；KQ5200E型超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；Multifuge X3R型高速冷冻离心机(美国Thermo Fisher Scientific公司)；WP-UP-IV-10型超纯水机(四川沃特尔科技发展有限公司)。

1.2 试药 槲皮苷对照品(成都植标化纯生物技术有限公司，批号：181216，纯度：≥98%)；异槲皮苷对照品(批号：wkq18022308，纯度：≥98%)、槲皮素对照品(批号：wkq18030806，纯度：≥98%)均购于四川省维克奇生物科技有限公司；乙腈色谱纯；其他试剂均为分析纯；水为超纯水。

1.3 药材 合欢花药材购于山东，经贵州医科大学刘春花副教授鉴定为豆科双子叶植物合欢AlbiziajulibrissinDurazz.的干燥花序或花蕾。药材来源见表1。

表1 药材来源及信息

2 方法与结果

2.1 色谱条件 色谱柱：Waters CORTECS C18(150 mm×4.6 mm，2.7 μm)；流动相：乙腈(A)-0.1%磷酸水(B)，梯度洗脱(0～5 min，5%A～15%A，5～30 min，15%A～20%A，30～40 min，20%A～95%A)；流速：1 mL/min；检测波长：270 nm；柱温：30℃；进样量：10 μL。

2.2 溶液的制备

2.2.1 对照品溶液的制备 分别精密称取槲皮苷、槲皮素、异槲皮苷对照品，用甲醇溶解制成1.430、0.4350、0.5250 mg/mL的对照品贮备溶液。分别精密量取上述单一对照品贮备液0.2 mL，置于5 mL量瓶中，加甲醇定容至刻度，摇匀，即得浓度分别为0.0572、0.01740、0.02100 mg/mL混合对照品溶液。

2.2.2 供试品溶液的制备 取本品粉末(过三号筛)约1 g，精密称定，置于100 mL具塞锥形瓶中，精密加入75%甲醇25 mL，称定质量，超声处理30 min，取出，放冷，称定质量，补重，摇匀，离心10 min(12 000 r/min)，即得。

2.3 方法学考察

2.3.1 系统适用性试验 取“2.2”项下混合对照品溶液、供试品溶液及空白溶液各10 μL，进样测定，记录色谱图，结果表明，空白对照对测定无干扰，所测指标槲皮苷分离度R>1.5，理论塔板数按槲皮苷计不低于30000，色谱图如图1所示。

A.空白溶液

B.混合对照品溶液

C.供试品(S7)溶液图1 高效液相色谱图

2.3.2 线性关系考察 分别精密量取槲皮苷对照品贮备液0.1、0.2、0.5、0.8、1.0、1.5 mL，置2 mL量瓶中，加甲醇定容，摇匀，即得系列浓度对照品溶液，进样测定，以槲皮苷浓度(x)对峰面积(y)进行线性回归，计算出线性回归方程为y= 376.7x+ 7.738(r=0.999 6)，表明槲皮苷在0.07150～1.073 mg/mL范围内呈良好线性关系。

2.3.3 检测限与定量限考察 精密量取“2.2.1”项下槲皮苷对照品溶液适量，倍比稀释，进样测定，记录峰面积。以信噪比为3∶1、10∶1相对应的浓度为检测限、定量限。结果表明，槲皮苷的检测限、定量限分别为0.07150 μg/mL、0.2383 μg/mL。

2.3.4 精密度试验 取合欢花药材(S7)约1 g，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，连续进样测定6次，以10号峰槲皮苷为参照，记录12个共有峰的相对保留时间和相对峰面积。结果表明，各共有峰相对保留时间的RSD均小于0.21%(n=6)，相对峰面积的RSD均小于0.98%(n=6)，槲皮苷峰面积的RSD为0.088%(n=6)，表明仪器精密度良好。

2.3.5 稳定性试验 取合欢花药材(S7)约1 g，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，分别于室温下放置0、2、4、8、12、24 h时按“2.1”项下色谱条件进样测定，以10号峰槲皮苷为参照，记录12个共有峰的相对保留时间和相对峰面积。结果表明，各共有峰相对保留时间的RSD均小于0.33%(n=6)，相对峰面积的RSD均小于2.9%(n=6)，槲皮苷峰面积的RSD为0.30%(n=6)，表明供试品溶液在室温下放置24 h内稳定性良好。

2.3.6 重复性试验 取合欢花药材(S7)约1 g，按“2.2.2”项下方法平行制备6份供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件进样测定，以10号峰槲皮苷为参照，记录12个共有峰的相对保留时间和相对峰面积，并计算样品含量。结果表明，各共有峰相对保留时间和相对峰面积的RSD均小于3.0%(n=6)，槲皮苷的平均含量为13.72 mg/g，RSD为0.30%(n=6)，表明本方法重复性良好。

2.3.7 加样回收率试验 取已知槲皮苷含量的合欢花药材(S7)6份，每份0.5 g，精密称定，精密加入槲皮苷对照品溶液适量，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件进样测定，记录峰面积，计算回收率。结果表明，槲皮苷的平均回收率为97.75%，RSD为0.25%(n=6)。详见表2。

表2 加样回收率试验(n=6)

2.4 HPLC指纹图谱的建立及相似度评价、共有峰的指认

2.4.1 HPLC指纹图谱的建立 取16批合欢花药材，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件进样测定。将得到的色谱图导入《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》(2012版)进行分析，得16批药材样品的HPLC叠加指纹图谱和对照指纹图谱，如图2、图3所示。

图2 16批药材样品叠加指纹图谱

图3 药材样品HPLC对照指纹图谱

2.4.2 相似度评价 采用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》(2012版)，进行整体相似度评价，结果显示，16批合欢花药材的相似度均大于0.90，表明药材样品间化学成分具有良好的一致性。详见表3。

表3 16批样品指纹图谱相似度评价结果

2.4.3 共有峰的指认 16批药材样品共有12个共有峰，通过与混合对照品溶液HPLC图(图1)比对，指认了3个共有峰，即8号峰为异槲皮苷，10号峰为槲皮苷，12号峰为槲皮素，其中10号峰槲皮苷出峰时间、峰面积均较为稳定，故选择其为参照峰，计算其他共有峰的相对保留时间及相对峰面积，结果显示，各共有峰相对保留时间RSD均小于0.28%，表明各批次间共有峰出峰时间较为稳定，相对峰面积RSD为0%～24.20%，说明不同批次间化学成分含量差异较大。

2.5 样品含量测定 取16批合欢花药材各适量，按“2.2.2”项下方法平行制备供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件进样测定，记录峰面积并计算样品含量。详见表4。

表4 样品含量测定结果 (n=2，%)

2.6 化学模式识别研究

2.6.1 聚类分析 (CA)采用SPSS 22.0软件，以各共有峰的峰面积为变量，结合欧氏距离为度量标准，对16批药材样品进行聚类分析，如图4所示。由图4可知，取欧氏距离为10时，16批药材样品可聚为2类，S1～S5、S8～S12、S15～S16聚为一类，S6～S7、S13～S14聚为一类。

图4 16批药材样品聚类分析树状图

2.6.2 主成分分析(PCA) 采用SIMCA 14.1软件，以标准化后的各共有峰的峰面积为变量，进行主成分分析，得到主成分的特征值和方差贡献率，详见表5，结果表明，前两个主成分因子的累积方差贡献率为99.275%>85%，能够反映合欢花指纹图谱中共有峰的大部分信息。图5为16批药材样品的PCA散点得分图，结果表明，16批药材样品可分为2类，I类样品为S6～S7、S13～S14，II类样品为S1～S5、S8～S12、S15～S16，该现象与聚类分析结果基本一致。载荷图表明2、3、10号色谱峰对药材的整体质量起主要影响作用，如图6所示。

表5 两个主成分因子的特征值和方差贡献率

图5 16批药材样品的PCA散点得分图

图6 16批药材样品的主成分载荷图

2.6.3 正交偏最小二乘法判别分析(OPLS-DA)

为了更好的分析不同样品间差异，本研究进一步采用有监督的OPLS-DA模型进行建模分析，结果表明，该方法将合欢花分成2类，如图7所示。OPLS-DA模型中的拟合参数R2X=0.987，R2Y=0.829，模型预测参数Q2=0.713，均大于0.5，表明建立的数学模型稳定可靠。以VIP>1为标准，筛选导致质量差异的主要标记成分，即10号峰(槲皮苷)，如图8所示。该结果与PCA分析中载荷图寻找的重要性权重变量大体一致，提示在合欢花药材的利用中需重点关注此成分的质量变化。

图7 16批药材样品的OPLS-DA散点得分图

图8 16批药材样品各活性成分的VIP图

3 讨论

本实验在样品处理过程中，通过对不同提取方式(超声、回流)、提取时间(30 min、60 min、90 min)、溶剂种类(甲醇、乙醇)进行考察，确定了合欢花样品制备的方法，即以75%甲醇超声提取30 min制备供试品溶液。

色谱条件考察了甲醇-水、乙腈-水、甲醇-0.1%甲酸水、乙腈-0.1%磷酸水溶液等流动相体系和Waters CORTECS C18、ACE Excel-5 C18等2种色谱柱对峰形、分离度的影响，发现选择Waters CORTECS C18色谱柱、乙腈-0.1% 磷酸水作为流动相时色谱峰峰形良好，分离度效果最佳。进行全波长扫描以比较不同波长下的图谱信息，发现在270 nm处色谱峰数较多，因此将其作为最佳检测波长。

本实验建立了合欢花HPLC指纹图谱，确定了12个共有峰，通过对照品对其中3个化学成分进行指认，16批药材相似度均大于0.90，相对保留时间RSD均小于0.28%，表明药材整体质量一致性较好，相对峰面积RSD范围为0%～24.20%，化学成分含量差异较大，可能与产地的土壤、气候、土质等有关[16]。

中药化学成分复杂，容易受诸多因素影响而导致质量的优劣差异，模式识别则为建立更加完整和科学的中药质量评价体系提供一个新的思路[17]。因此，为更好的辨别药物之间的质量差异，本实验结合CA、PCA、及OPLS-DA三种模式识别方法对合欢花指纹图谱进一步分析，根据聚类分析与主成分分析结果，16批合欢花药材被分成2类，S1～S5、S8～S12、S15～S16为一类，S6～S7、S13～S14为一类。表明指纹图谱可能与生长环境和采收季节存在一定的相关性，而导致药材不同批次之间分类上的差异。经OPLS-DA分析，筛选到了1种差异性质量标志成分，即10号峰。槲皮苷含量测定的结果显示，S16样品质量分数仅为0.33%，其余15批次样品质量分数为0.77%～1.31%，可见合欢花药材虽为同一产地，但不排除因为采收时间、贮藏条件的不同造成含量差异的可能。因此，合欢花药材的质量控制应从产地采收、加工等源头着手，需重点关注槲皮苷含量的变化，严格把控药物质量。

本研究通过指纹图谱与化学模式识别结合的方式，找出影响合欢花整体质量的差异性成分，并对其进行含量测定，揭示了合欢花的内在质量，该方法简便易行，同时具有灵敏度高、特征性强等优点，从多角度较为全面、系统的对药材质量进行控制，同时也为药材的合理利用提供依据。